Summary
L'observation microscopique-sensibilité aux médicaments (MODS) de dosage est un faible coût, faible technicité outil de haute performance de détection de la tuberculose (TB) et la tuberculose multirésistante (tuberculose à bacilles multirésistants). Cette vidéo décrit le liquide MODS la méthode de culture des médias.
Abstract
Les patients atteints de tuberculose pulmonaire (TB) active infecter d'autres personnes de 10 à 15 par an, ce qui rend le diagnostic de tuberculose active essentielle à la fois à guérir le patient et la prévention des nouvelles infections. Par ailleurs, l'émergence de la tuberculose multirésistante (tuberculose à bacilles multirésistants) signifie que la détection de la résistance aux médicaments est nécessaire pour arrêter la propagation de souches résistantes aux médicaments. L'observation microscopique-sensibilité aux médicaments (MODS) de dosage est un faible coût, faible technicité outil de haute performance de détection de la tuberculose et TB-MR. Le test MODS est basé sur trois principes: 1) de Mycobacterium tuberculosis (MTB) croît plus vite dans les milieux liquides que sur milieu solide 2) la croissance VTT microscopiques peuvent être détectés plus tôt dans les milieux liquides que d'attendre que l'aspect macroscopique des colonies sur milieu solide, et que la croissance est caractéristique de VTT, qui lui permet d'être distinguée de la contamination mycobactéries ou fongiques ou bactériennes atypiques 3) les médicaments isoniazide et la rifampicine peuvent être incorporés dans le test MODS pour permettre une détection directe simultanée de tuberculose à bacilles multirésistants, éliminant la nécessité d'une sous-culture à effectuer un test de drogue indirects susceptibilité. La concurrence des diagnostics actuels sont entravés par une faible sensibilité aux frottis de crachats, de longs délais jusqu'à ce diagnostic avec la culture médiatique solide, avec des coûts prohibitifs des méthodes existantes de liquide milieux de culture, et la nécessité de ne sous-culture pour les tests de sensibilité aux médicaments indirectes pour détecter la tuberculose multirésistante. En revanche, la méthode non-propriétaires MODS a une sensibilité élevée pour la tuberculose et tuberculose à bacilles multirésistants, est une méthode de culture relativement rapide, offre simultanée des tests de sensibilité aux médicaments pour la tuberculose multirésistante, et est accessible aux ressources limitées à un peu moins 3 $ pour les tests pour la tuberculose et TB-MR.
Protocol
- Préparer des solutions étalons
- Stock tampon phosphate
- Mélanger 950ml de sodium dibasique solution (9.47g de phosphate dibasique de sodium dissous dans l'eau distillée 1000ml) avec 950ml de solution de phosphate de potassium monobasique (9.07g de phosphate de potassium monobasique dissous dans l'eau distillée 1000ml) et remuer; retenir 50ml de chaque solution pour ajuster pH si nécessaire
- Ajuster le pH à 6,8 ± 0,2: ajouter le phosphate de sodium dibasique solution pour augmenter le pH, ajouter une solution de phosphate de potassium monobasique pour abaisser le pH
- Autoclave à 121-124 ° C pendant 15 minutes pour stériliser
- Assiette une aliquote de 100 ul de la solution tampon phosphate sur milieu nutritif gélosé dans une boîte de Pétri et incuber à 37 ° C pendant 48 heures pour confirmer la stérilité
- Conserver au réfrigérateur à 2-8 ° C pendant jusqu'à un mois
Remarque: Chaque échantillon d'expectoration nécessite 10ml de solution tampon phosphate
- Décontamination des stocks
- Combiner des volumes égaux de solution d'hydroxyde de sodium (8.0g d'hydroxyde de sodium dissous dans 200ml d'eau distillée stérile) et la solution de citrate de sodium (5.8g de citrate de sodium distillée dans 200ml d'eau distillée stérile)
- Mélanger et autoclave à 121-124 ° C pendant 15 minutes
- Conserver au réfrigérateur à 2-8 ° C pendant jusqu'à un mois
Remarque: Chaque échantillon d'expectoration nécessite 2ml de stock de décontamination
- Milieux de culture des stocks
- Into 900ml d'eau distillée stérile ajouter 3.1ml de glycérol et 1,25 g d'casitone et 5,9 g de poudre de support 7H9; mélanger avec une agitation constante jusqu'à dissolution complète
- Autoclave à 121-124 ° C pendant 15 minutes
- Laisser refroidir et diviser le milieu stérile en aliquots de 4,5 ml de stériles 16x 100 mm pour des tubes de verre de préparation d'échantillon, et 10.8ml aliquotes pour la préparation des solutions antibiotiques et des contrôles internes
- Incuber à 37 ° C pendant 48 heures pour vérifier la stérilité (absence de turbidité)
- Conserver à 2-8 ° C avec bouchon fermé pour jusqu'à un mois
Remarque: Chaque échantillon d'expectoration nécessite 4,5 ml d'un tube contenant du milieu 7H9
- Solutions concentrées d'antibiotiques
- A. isoniazide stock (8 mg / ml)
- Dissoudre 20 mg d'isoniazide complètement dans 2.5ml d'eau distillée stérile
- Filtre avec filtre seringue 0,2 um pour le solvant aqueux
- Boutique en aliquots de 20 pi stériles tubes de centrifugation micro à -20 ° C pendant jusqu'à 6 mois
Remarque: Chaque aliquote stocké 20 pi est suffisant pour un maximum de 100 échantillons (y compris les pertes)
- B. La rifampicine stock (8 mg / ml)
- Dissoudre la rifampicine 20mg complètement dans 1,25 ml de DMSO
- Ajouter 1,25 ml d'eau distillée stérile et mélanger
- Filtre avec filtre seringue 0,2 um pour les solvants organiques
- Boutique en aliquots de 20 pi microtubes stériles à -20 ° C pendant jusqu'à 6 mois
Remarque: Chaque aliquote stocké 20 pi est suffisant pour un maximum de 100 échantillons (y compris les pertes)
- A. isoniazide stock (8 mg / ml)
- Stock tampon phosphate
- Préparer des solutions de travail
- Solution de décontamination de travail
- Dissoudre 0,1 g de cristaux NALC dans toutes les 20ml de solution de décontamination requis
Remarque: Chaque échantillon doit de 2ml de solution de décontamination
Remarque: Jeter toute solution de décontamination NaOH NALC qui reste inutilisée après 24 heures que NALC perd son activité mucolytique au fil du temps
- Dissoudre 0,1 g de cristaux NALC dans toutes les 20ml de solution de décontamination requis
- Milieux de culture solution de travail
- Partez:
- 1 tube avec support 7H9 pour chaque échantillon d'expectoration à traiter, plus 1 tube supplémentaire pour chaque plaque (pour la colonne de contrôle négatif)
- 2 tubes de milieu 7H9 pour les contrôles positifs (3 si des souches monorésistants sont utilisés)
- 1-2 tubes avec 7H9 10.8ml pour la préparation de solution d'antibiotiques
- Ajouter 0,5 ml OADC à l'4,5 ml d'7H9 dans chaque tube d'échantillon
- Ajouter 1,2 ml d'OADC tubes avec 7H9 10.8ml
- Mettez de côté deux tubes avec 5ml 7H9-OADC pour les contrôles positifs, et le tube (s) avec 12ml 7H9-OADC être utilisé pour la préparation solution antibiotique (ceux-ci ne nécessitent PANTA)
- PANTA Reconstituer et ajouter 0,1 ml dans chaque tube d'échantillon et les tubes de contrôle négatif (7H9-OADC-PANTA: volume total = 5.1ml)
Remarque: milieu complet avec PANTA (7H9-OADC-PANTA) est utilisée pour les échantillons de crachats et les contrôles négatifs, l'utilisation 7H9-OADC sans PANTA pour les contrôles positifs et pour la préparation de solution d'antibiotiques
- Partez:
- Antibiotique solutions de travail
- 1. Voir la Figure 1 pour les étapes à faire de la solution antibiotique travaillant dans une partie inutilisée de 24 puits Plaque
Note: Pour les résultats de sensibilité précis, les concentrations finales des antibiotiques sont essentiels. La procédure suivante est adapté pour lABORATOIRES équipé micropipettes. Si micropipettes sont pas disponibles, des seringues à tuberculine peut être utilisé avec une autre série de dilutions décrites dans le Guide de l'utilisateur Annexe 3 au modsperu.org
Note: Ne pas recongeler ou réutilisation de travail des antibiotiques ou des solutions de stock que l'activité des médicaments peuvent être perdus Ecarter les solutions inutilisées aux antibiotiques à la fin de la figure 1 jour de traitement.. Rendre les solutions antibiotiques de travail (de Guide de l'utilisateur au modsperu.org)
- 1. Voir la Figure 1 pour les étapes à faire de la solution antibiotique travaillant dans une partie inutilisée de 24 puits Plaque
- Solution de décontamination de travail
- Échantillon de crachats et de la plaque préparation
- De décontamination
- 2ml Lieu de crachats dans un tube à centrifuger 15ml (si moins, faire jusqu'à 2ml avec un tampon phosphate; si plus, utilisez uniquement 2ml)
- Ajouter 2 ml de NaOH NALC solution
- Tube de Cap hermétiquement et vortex pendant 20 secondes; Retourner le tube d'assurer des contacts solution de NaOH-NALC toute la surface intérieure du tube et le couvercle
- Laisser reposer pendant un minimum de 15 minutes - peut prolonger de quelques minutes si l'échantillon est particulièrement visqueux. Pour éviter plus de traitement, ne doivent pas dépasser 20 minutes
- Remplir le tube d'14ml avec un tampon phosphate (pH 6,8) pour neutraliser les alcalis et terminer le processus de décontamination, et bien mélanger en inversant le tube 4 fois
- Centrifuger à 3000 g pendant 15 minutes (voir l'annexe 2 du Guide de l'utilisateur au modsperu.org pour l'équation de rotations par minute nécessaire pour atteindre 3000 g)
- Versez délicatement le surnageant dans un récipient de déchets liquides à l'hypochlorite de sodium à 10% ou un autre désinfectant approprié et conserver le culot
- Préparation de la suspension de l'échantillon final et de sauvegarde
- Utiliser 7H9-OADC-PANTA (à partir du tube contenant 5.1ml), resuspendre le culot de l'échantillon dans un volume total de 2ml dans le tube de centrifugeuse avec une pipette Pasteur et bien mélanger
- Retirer 1ml de la suspension de l'échantillon et de stocker dans un microtube à 2-8 ° C en tant que sauvegarde
- Ajouter la seconde 1ml de la suspension de l'échantillon dans le tube avec le reste 7H9-OADC-PANTA et bien mélanger. C'est la solution de l'échantillon final soit prêt pour le placage
- Placer l'échantillon dans les suspensions de 24 puits Plaque
- 900μl lieu de la suspension de l'échantillon final dans chacun des 4 puits d'une colonne dans la plaque de 24 puits
- Répétez l'opération avec d'autres échantillons jusqu'à ce que toutes les colonnes de la plaque, sauf la colonne 3, sont remplies (ou jusqu'à ce que tous les échantillons sont plaqués)
- Lieu de 900μl 7H9-OADC milieu sans échantillon dans le puits 4 de la colonne 3 de chaque plaque échantillon (négatif contrôles internes)
- Ajout d'antibiotiques à des échantillons
- Avec une pipette multi-canaux, remplir soigneusement quatre pointes avec 100 ul dans les puits avec 7H9-OADC et antibiotique solutions de travail (colonne 2 de la dilution des antibiotiques plaques voir figure 1)
- Ajouter les aliquotes 100 ul de la colonne 1 puits avec des solutions d'échantillon 900μl sans toucher la plaque ou un échantillon
- Répétez jusqu'à ce que toutes les colonnes ont reçu les 100 ul supplémentaires de moyenne (sans drogue puits) ou des solutions antibiotiques (y compris les colonnes de contrôle négatif 3)
- Refermez la plaque avec son couvercle et placer dans un refermable en polyéthylène (Ziplock) sac et sceller (sac n'est pas ouvert à nouveau à partir de ce point)
- Incuber à 37 ° C (enrichissement en CO 2 n'est pas nécessaire)
- De décontamination
- Contrôle de la qualité
- Des contrôles négatifs sont exécutés sur chaque assiette. La présence de toute la croissance dans l'un des puits dans la colonne de contrôle négatif indique une contamination croisée, par conséquent toute la plaque doit être mis au rebut et les échantillons re-plaqué.
- Les contrôles positifs sont exécutés sur une plaque séparée, à la fin de la journée. Un totalement sensibles aux médicaments souche est exécuté dans une colonne et une souche résistante à l'INH et RIF est exécuté dans une autre colonne. Si on se préoccupe de l'exécution d'une souche multirésistante, à la fois une contrainte et une INH monorésistants FRR souche monorésistants peut être exécuté à l'endroit des souches sensibles et MDR. Tous les contrôles positifs doivent avoir une croissance dans le puits sans médicament pour démontrer que le soutien à la croissance des médias. Pour démontrer que les concentrations de médicament sont corrects, la souche sensible ne devraient pas croître dans l'INH ou FRR puits, mais la souche multirésistante doit croître aussi se développer dans l'INH et RIF puits.
- Lecture des plaques
- Avec le jour de plaquage comme «Jour 0", la lecture de la plaque commence le jour 5, et si elle est négative le jour 5 lecture se fait chaque jour (ou deux jours selon la charge de travail) jusqu'au jour 14, puis tous les 2-3 jours à partir de 15 jours -21. Les plaques sont examinées sur unemicroscope inversé la lumière avec l'objectif 10x
- Une culture positive est celle dans laquelle il ya deux ou plusieurs unités formant colonies (> 2 UFC) dans les deux puits sans drogue. Au début de croissance mycobactérienne ressemble petites virgules courbes ou spirales (jours 5-9). La formation de colonies progresse habituellement de «cordes» ou «enchevêtrements» (voir la bibliothèque d'images sur le modsperu.org)
- Le jour d'une culture est positive dans les deux puits sans drogue, les puits contenant un médicament doit être lu. Toute la croissance de la présence d'un médicament indique la résistance à ce médicament.
Remarque: Si la lecture des puits contenant des médicaments se fait> 1 semaine après une culture positive est noté dans le puits sans drogue, cela peut ne pas représenter la résistance que la percée de croissance est parfois observée
- Les échantillons qui ne sont pas positifs au jour 21 sont considérées comme des cultures négatives
- La nébulosité des puits est le résultat d'une prolifération de contamination, alors que la croissance mycobactérienne ne résulte pas de la nébulosité
- Au terme de 21 jours des cultures peut être jeté. Cultures rester dans leurs sacs scellés et sont placés dans des sacs en autoclave et autoclave à 121-124 ° C pendant 45-60 minutes
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Discussion
Le test MODS est destiné aux ressources limitées. Pour la première fois, MODS apporte la capacité de détection rapide de la culture liquide de la tuberculose et la tuberculose multirésistante aux ressources limitées à un peu moins de 3 $ par test. MODS est un non-propriétaires, méthodologie itérative, et la communauté MODS est toujours intéressé à l'amélioration d'autres laboratoires ont réussi à faire.
Une préoccupation récurrente est la biosécurité de la culture des milieux liquides de la tuberculose, car les liquides peuvent être renversé ou en aérosol. Nous pensons que le dosage MODS est plus que tout autre BioSafe test qui consistait à tester la sensibilité médicamenteuse indirects parce indirects tests de sensibilité aux médicaments implique la manipulation de solutions très concentrées de mycobactéries avec les risques de déversement et aérosolisation; en revanche, MODS implique simplement l'inoculation de un échantillon de crachats dans une assiette, après quoi la plaque est scellée dans un sac en plastique et jamais ouvert. Ceci est appuyé par des données de la Corée (Kim 2007) qui a montré que le risque professionnel pour les travailleurs de laboratoire qui étale des échantillons d'expectorations sans faire tests de sensibilité n'est pas supérieure à celle de travailleurs faisant examen microscopique de frottis, en revanche, ceux qui font de drogue tests de sensibilité ont beaucoup plus de risques professionnels pour la tuberculose.
Nous recommandons fortement qu'aucune de ces procédures soient menées sans les précautions appropriées pour les travailleurs de laboratoire. Cela inclut masques N-95 pour la protection respiratoire individuelle, une classe 2 enceinte de sécurité biologique de l'air épuisée filtrée à travers des filtres HEPA et un verrou sur la porte du laboratoire d'arrêter les turbulences du flux d'air tandis que les échantillons sont manipulés.
Les procédures d'exploitation standard pour le traitement des échantillons extrapulmonaires, une photothèque de Mycobacterium tubercuclosis et d'autres mycobactéries et la contamination bactérienne et fongique, une stratégie de qualité recommandée d'assurance, une procédure d'accréditation des laboratoires pour commencer à utiliser MODS, et une page de FAQ sont disponibles à modsperu.org
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Acknowledgments
Nous tenons à remercier Sean Fitzwater et Carmen Luna Giannina de Colombo pour le segment de croissance de tuberculose vidéo time-lapse. Nous tenons à remercier Marty Roper pour sa rétroaction approfondie et un excellent cours de l'édition et co-auteur du Guide de l'utilisateur, à partir de laquelle le protocole actuel a été prise essentiellement verbatim. La production de cette vidéo a été financée par le NIH / Fogarty International Center http://www.fic.nih.gov/ David Moore AJ contribué en tant que boursier de recherche clinique de Wellcome Trust en Médecine Tropicale et Reader en maladies infectieuses de l'Imperial College de Londres (Fellowship 078067/Z/05 plusieurs prix). Mark F. Brady contribué tant que boursier du NIH / Fogarty International Research Center.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Refrigerator/ freezer | Equipment | to store pre-prepared broth and antibiotic stocks | ||
| Vortex | Equipment | to aid sputum decontamination | ||
| Centrifuge | Equipment | for sputum concentration; capable of reaching 3000 g; d–s not need to be refrigerated, but MUST be biosafe (buckets can be sealed) | ||
| Incubator (37 degree C) | Equipment | for culture; need not be CO2 enriched | ||
| Inverted light microscope | Microscope | to read MODS plates | ||
| Autoclave | Equipment | to sterilize media, PBS and used plates | ||
| Balance | Equipment | to weigh isoniazid, rifampicin and NALC | ||
| Middlebrook 7H9 broth (Difco) | Reagent | Fisher Scientific | DF0713-17-9 | 500gr/bottle; culture media base |
| Casitone (pancreatic digest casein) | Reagent | Fisher Scientific | DF0259‐17‐9 | 500gr/bottle; culture media base |
| Glycerol (glycerin) lyophilized | Reagent | Sigma-Aldrich | G‐33‐500 | 500ml/bottle; culture media base |
| PANTA (Antibiotic mixture lyophilized BD) | Reagent | Fisher Scientific | B4345114 | 6 bottles/pack; antibiotic media supplement |
| OADC (Middlebrook OADC enrichment BD) | Reagent | Fisher Scientific | B11886 | 10 x 20ml/pack; nutritional media supplement |
| Dimethyl sulphoxide (Hibri-Max) | Reagent | Sigma-Aldrich | D-2650 | 100ml/bottle; to prepare rifampicin stock |
| Antibiotic stocks: isoniazid | Reagent | Sigma-Aldrich | I-3377 | 50gr/bottle; direct susceptibility testing |
| Antibiotic stocks: rifampicin | Reagent | Sigma-Aldrich | R-3501 | 1gr/bottle; direct susceptibility testing |
| Sodium hydroxide (pellets) | Reagent | Sigma-Aldrich | 221465 | 500gr/bottle; sputum decontamination |
| Sodium citrate (trisodium salt dihydrate) | Reagent | Sigma-Aldrich | S-4641 | 500gr/bottle; sputum decontamination |
| N-acetyl-L-cysteine | Reagent | Sigma-Aldrich | A-7250 | 50gr/bottle; sputum decontamination |
| Potassium Phosphate Monobasic crystal. KH2PO4 | Reagent | Sigma-Aldrich | P0662 | 500gr/bottle; sputum decontamination |
| Sodium Phosphate Dibasic, anhydrous. Na2HPO4 | Reagent | Sigma-Aldrich | S0876 | 500gr/bottle; sputum decontamination |
| Sodium hypochlorite | Reagent | household bleach | to discard contaminated waste | |
| 15ml centrifuge tubes (polypropylene 15ml Falcon 35‐2096) | Consumable | Fisher Scientific | 14‐959‐49B | 500ea/case; for sputum decontamination and concentration |
| 24 well plates (Plates Tissue 24 wells BD Falcon 35‐3047) | Consumable | Fisher Scientific | 08-772-1 | 50 plates/case; for culture and reading |
| Sealable polythene bags 6 X 6 “ (ziplock) | Consumable | for biosecurity to contain 24 well plate | ||
| Glass tubes with lid (16 x 100mm and 18 x 145mm) | Consumable | VWR international | 47729-583 | 500 tubes/case; to store aliquots of prepared broth |
| Screw cap microcentrifuge tubes (1.5ml) | Consumable | Fisher Scientific | 05‐669‐22 | 1000ea/case; to store aliquots of antibiotic stocks |
| 0.22μm filters (aqueous solvents) Syringe filter Millex blue | Consumable | Fisher Scientific | SLGL 025 OS | 50 units/case; to filter antibiotic stocks |
| 0.22μm filters (organic solvents) Syringe filter Millex yellow | Consumable | Fisher Scientific | SLGV 033 RS | 50 units/case; to filter antibiotic stocks |
| Disposable Pasteur pipettes borosilicate glass 9″ | Consumable | Fisher Scientific | 13‐678‐20C | 720ea/case; to mix PANTA with media mix |
| Aerosol barrier tips 1000‐1300μl | Consumable | Fisher Scientific | 02‐707‐51 | 1000ea/pk; to dispense media into plate |
| USA Scientific Tips One 1‐200μl yellow tips | Consumable | Fisher Scientific | 1111‐0006 | 1000 tips/bag; to dilute antibiotic stocks |
References
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