Una técnica rápida para la visualización en vivo de las células de levadura inmovilizada

Summary

Una técnica rápida para la visualización de crecimiento de las células de levadura inmovilizada, aquí se aplica a los reporteros fluorescentes en el silencio de apareamiento loci HML y HMR

Abstract

Presentamos aquí una técnica sencilla, rápida y extremadamente flexible para la inmovilización y la visualización de las células de levadura crece por microscopía de epifluorescencia. La técnica es ideal para la visualización de las poblaciones de levadura estática, o experimentos de los cursos de tiempo de hasta diez horas de duración. Mi microscopio investiga la herencia epigenética en los loci de apareamiento en silencio en S. cerevisiae. Hay dos loci de apareamiento en silencio, HML y HMR, que normalmente no se expresan como están empaquetadas en heterocromatina. En el silencio de fondo SIR1 mutante se ha debilitado de tal manera que cada lugar puede ser en el estado expresados ​​o silenciados epigenética, por lo que en la población en su conjunto hay una mezcla de células de los diferentes estados epigenéticos, tanto para HML y HMR. Mi microscopio demostró que no hay relación entre el estado epigenético de HML y HMR en una celda individual. SIR1 células estocásticamente cambiar estados epigenéticos, el establecimiento de silenciar a un lugar previamente expresada o expresar un lugar antes silenciadas. Mi evolución en el tiempo un seguimiento de microscopía individuales SIR1 las células y su descendencia para anotar la frecuencia de cada uno de los cuatro interruptores epigenéticos es posible, y por lo tanto la estabilidad de cada uno de los estados epigenéticos en las células SIR1. Véase también Xu et al., Mol. Celular 2006.

Protocol

1. Células inmovilizadas para la microscopía de epifluorescencia curso. Tenga en cuenta que este protocolo sólo es útil si las lentes del objetivo del microscopio están por debajo de la platina del microscopio.
   
   
2. Células de lugar a la concentración deseada en medios líquidos en un cubreobjetos de largo (aproximadamente 24x50mm)
   
   
3. Corte un bloque de agar con el tamaño deseado de una placa de medio sintético (éstas tienen un menor autofluorescencia) y el lugar en las células. Coloque el lado del bloque de agar no se manejan por pinzas en contacto con las células.
   
   
4. Para los cursos de tiempo más corto (hasta 3 horas), esta configuración es suficiente. Si las células se mueven cuando se visualiza en el microscopio, disminuir el volumen de las células o aumento de área del bloque de agar.
   
   
5. Para los cursos de tiempo más largo, se coloca una gota de agua dulce de medios líquidos en la parte superior del bloque de agar, y colocar una lámina de vidrio en la parte superior del bloque de agar. En esta diapositiva se reduce la evaporación a través de la parte superior del bloque de agar. Si lo desea, los bordes del bloque de agar en contacto con la hoja de la cubierta se pueden sellar con vaselina para reducir aún más la humedad. He utilizado esta configuración para películas de hasta 9 horas de duración, con la células que se dividen en las tasas de tipo salvaje.

Discussion

Esta es una técnica rápida que inmoviliza a las células de levadura al tiempo que permite el crecimiento. Hemos seguido el crecimiento de levadura para un máximo de diez horas, con la levadura salvaje mostrando tasas de la división de tipo durante todo el experimento. Tenga en cuenta que esta configuración requiere que la lente del objetivo por debajo de la platina del microscopio.