ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में लारवल सीएनएस के विच्छेदन

Summary

हम इस लेख में प्रदर्शित कैसे तीसरे instar ड्रोसोफिला लार्वा से केंद्रीय तंत्रिका तंत्र टुकड़े करना.

Abstract

ड्रोसोफिला लार्वा के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (CNS) जटिल और खराब समझ है. सीएनएस जांच immunohistochemistry का उपयोग करने के लिए विभिन्न उपन्यास और मार्कर प्रोटीन की अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए है. पूरे लार्वा की धुंधला अव्यावहारिक है क्योंकि कठिन छल्ली शरीर गुहा के अंदर मर्मज्ञ से एंटीबॉडी को रोकता है. आदेश में इन ऊतकों दाग करने के लिए यह करने के लिए फिक्सिंग और धुंधला जानवर पहले काटना आवश्यक है. हम इस लेख में प्रदर्शित कैसे सीएनएस हानिकारक के बिना ड्रोसोफिला लार्वा टुकड़े करना. ठीक संदंश की एक जोड़ी के साथ आधे में लार्वा को फाड़ के द्वारा शुरू करो, और तब छल्ली "अंदर - बाहर" बारी करने के लिए सीएनएस बेनकाब. यदि विच्छेदन सावधानी से किया जाता है सीएनएस छल्ली के लिए संलग्न रहेगा. हम आम तौर पर निर्धारण और धुंधला कदम भर छल्ली से जुड़ी सीएनएस रखने के लिए, और केवल पूरी तरह से छल्ली से सीएनएस गिलास स्लाइड पर नमूने बढ़ते सिर्फ पहले हटायें. हम भी एक लार्वा ईव, CNS में न्यूरॉन्स की एक सबसेट में व्यक्त एक प्रतिलेखन कारक के साथ दाग सीएनएस के कुछ प्रतिनिधि छवियाँ दिखा. लेख कुछ इस तकनीक और संभावित कठिनाइयों पैदा हो सकता है कि व्यावहारिक का उपयोग करता है की एक चर्चा के साथ समाप्त.

Protocol

1. 3 ^Rd instar लार्वा काटना, छल्ली के लिए संलग्न सीएनएस छोड़कर. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में रखें.
2. पीबीएस (1x) में ठीक कमाल के साथ 40 मिनट के लिए 2% formaldehyde युक्त. , हर 5-10 dissected सीएनएस के लिए 250ul का प्रयोग करें.
3. Formaldehyde निकालें और संक्षिप्त के साथ 3 बार धो PBS 0.1 +% Triton एक्स 100 (PBST). एक पतले खींच पाश्चर विंदुक प्रयोग ऊतक के नुकसान से बचने के.
4. गैर विशिष्ट प्रोटीन बाध्यकारी साइटों को ब्लॉक और PBST में ऊतक 1-8 बजे incubating द्वारा कोशिका झिल्ली permeabilize + 5% BSA, 4 में कमाल की डिग्री सेल्सियस
5. प्राथमिक PBST + 5% BSA कमाल में 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पतला एंटीबॉडी में सेते हैं. इष्टतम एंटीबॉडी कमजोर पड़ने विभिन्न एंटीबॉडी के लिए अलग अलग होंगे.
6. PBST में 3x 4 बजे दो 30min washes डिग्री सेल्सियस द्वारा बाद कुल्ला
7. माध्यमिक PBST में पतला एंटीबॉडी में सेते + 1-3 बजे 4 बजे घोड़ा के लिए 5% BSA डिग्री सेल्सियस PBST में 3x 4 बजे दो 30min washes डिग्री सेल्सियस द्वारा बाद कुल्ला यदि माध्यमिक प्रकाश के प्रति संवेदनशील परिसर को संयुग्मित है, ट्यूब एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटो.
8. ऊतक आगे काटना (यदि आवश्यक) और स्लाइड्स पर माउंट.

Discussion

इस वीडियो यह दर्शाता है कि कैसे तीसरे instar ड्रोसोफिला लार्वा से सीएनएस काटना. विच्छेदन के बाद, CNS के एक मानक immunohistochemistry प्रोटोकॉल का उपयोग दाग जा सकता है. वर्तमान में, अभी भी बहुत कैसे वयस्क तंत्रिका तंत्र के रूप में अच्छी तरह से यह कैसे भंडार के रूप में उत्पन्न होता है के बारे में अज्ञात है और जानकारी पहुंचाता है. विकासशील ड्रोसोफिला लार्वा सीएनएस के अध्ययन तंत्रिका तंत्र तारों और समारोह के हमारे ज्ञान को बढ़ाने चाहिए.

ड्रोसोफिला लार्वा stereotpyed व्यवहार, पर्यावरण cues के लिए एक प्रतिक्रिया के रूप में की एक संख्या दिखा रहे हैं. इन व्यवहारों और कैसे सीख रहे हैं तंत्रिका तंत्र में संग्रहीत? लार्वा के विकास के दौरान तंत्रिका तंत्र के अध्ययन के लिए इस सवाल का जवाब में मदद मिलेगी.

ड्रोसोफिला के विकास में इस स्तर पर, जीव विशाल morphological परिवर्तन है कि pupation के दौरान पाए जाते हैं कराने की तैयारी है. इस समय के दौरान, neuromuscular प्रणाली के भारी remodeling एक वयस्क मक्खी में एक कीड़ा रेंगने से organsim संक्रमण के रूप में होता है. यह कैसे न्यूरॉन्स विकास की इस अवस्था के दौरान परिवर्तन और अगर व्यवहार का एक ही प्रकार उच्च जानवरों के न्यूरॉन्स में मनाया जा सकता है है निर्धारित करने के लिए दिलचस्प हो जाएगा.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Forceps	fine tipped
9-well Watch glass
Plastic Petri dish