Dissecção do CNS Larval em Drosophila melanogaster

Summary

Neste artigo vamos demonstrar como dissecar o sistema nervoso central do terceiro instar as larvas Drosophila.

Abstract

O sistema nervoso central (SNC) de larvas de Drosophila é complexa e mal compreendida. Uma maneira de investigar o sistema nervoso central é a utilização de imuno-histoquímica para analisar a expressão do romance de várias proteínas e marcador. Coloração das larvas de todo é inviável porque a cutícula resistente impede anticorpos de penetrar no interior da cavidade do corpo. , A fim de mancha estes tecidos é necessário dissecar o animal antes de fixar e coloração. Neste artigo vamos demonstrar como dissecar as larvas Drosophila sem danificar o sistema nervoso central. Comece rasgando a larva ao meio com uma pinça fina, e depois vire a cutícula "dentro para fora" para expor o CNS. Se a dissecção é realizada com cuidado o SNC vai permanecer solidários com a cutícula. Costumamos manter o sistema nervoso central associadas à cutícula durante todas as etapas de fixação e coloração, e só remover completamente o sistema nervoso central da cutícula pouco antes da montagem das amostras em lâminas de vidro. Mostramos também algumas imagens de um representante do SNC larval corados com Eva, um fator de transcrição expresso em um subconjunto de neurônios no sistema nervoso central. O artigo conclui com uma discussão sobre alguns dos usos práticos da técnica e as dificuldades potenciais que possam surgir.

Protocol

1. Dissecar ³ de larvas, deixando CNS ligado à cutícula. Coloque em um tubo de 1,5 ml.
2. Fix na PBS (1x), contendo formaldeído 2% por 40 min com balanço. ; Use 250ul para todos os SNC 10/05 dissecados.
3. Remover formaldeído e brevemente lavar 3 vezes com PBS + 0,1% Triton X-100 (PBST). Use uma pipeta Pasteur finamente puxado para evitar a perda de tecido.
4. Bloquear sites não-específicos de ligação às proteínas e permeabilizar as membranas celulares através da incubação do tecido 1-8 horas em PBST + BSA 5%, balançando a 4 ° C.
5. Incubar em anticorpo primário diluído em PBST + 5% BSA balançando a 4 ° C durante a noite. Diluição do anticorpo ideal varia para diferentes anticorpos.
6. Enxágüe 3x no PBST seguido por duas lavagens 30min a 4 ° C.
7. Incubar em anticorpo secundário diluído em PBST + BSA 5% para 03/01 horas balançando a 4 ° C. Enxágüe 3x no PBST seguido por duas lavagens 30min a 4 ° C. Se o secundário é conjugado a um composto sensível à luz, enrole o tubo em papel alumínio.
8. Dissecar o tecido adicionais (se necessário) e montagem em slides.

Discussion

Este vídeo demonstra como dissecar o SNC de terceiro instar as larvas Drosophila. Após a dissecção, o SNC pode ser manchado usando um protocolo de imuno-histoquímica padrão. Atualmente, grande parte ainda é desconhecido sobre como o sistema nervoso adulto é gerado, bem como a forma como ele armazena e transmite informações. Estudos do desenvolvimento larval Drosophila CNS deverá reforçar o nosso conhecimento da fiação do sistema nervoso e função.

Larvas de Drosophila apresentam uma série de comportamentos stereotpyed, como uma resposta a estímulos ambientais. Como esses comportamentos aprendidos e armazenados no sistema nervoso? Estudos do sistema nervoso durante o desenvolvimento larval vai ajudar a responder esta pergunta.

Nesta fase em Drosophila desenvolvimento, o organismo está se preparando para sofrer as vastas mudanças morfológicas que ocorrem durante a pupação. Durante este tempo, remodelação maciça do sistema neuromuscular ocorre como as transições organsim de um verme rastejando em uma mosca adulta. Será interessante para determinar como os neurônios mudar durante este estágio de desenvolvimento e se o mesmo tipo de comportamentos podem ser observados nos neurônios dos animais superiores.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Forceps	fine tipped
9-well Watch glass
Plastic Petri dish