Препарирование личинок ЦНС у дрозофилы

Summary

В этой статье мы показали, как рассекают центральной нервной системы с третьего возраста личинок дрозофилы.

Abstract

Центральной нервной системы (ЦНС), личинок дрозофилы является сложным и плохо изучены. Один из способов исследовать ЦНС является использование иммуногистохимии для изучения экспрессии различных романа и маркеров белков. Окрашивание целом личинки нецелесообразно, так как жесткие кутикулы предотвращает антител от проникновения внутрь полости тела. Для того, чтобы пятно этих тканей необходимо препарировать животное до фиксации и окрашивания. В этой статье мы показали, как рассекают дрозофилы личинки без повреждения ЦНС. Начните с разрывая личинки пополам с парой тонких щипцов, а затем включите кутикулы "наизнанку", чтобы разоблачить ЦНС. Если вскрытие производится тщательно ЦНС будет оставаться прикрепленной к кутикуле. Мы обычно держат ЦНС придается кутикулы всей фиксации и окрашивания шагов, и только полностью удалить ЦНС от кутикулы незадолго до монтажа образцов на предметных стеклах. Мы также покажем некоторые характерные образы личиночной ЦНС витражи с Евой, транскрипционный фактор выражается в подмножество нейронов в ЦНС. Статья завершается обсуждением некоторых практических применений этой техники и возможные трудности, которые могут возникнуть.

Protocol

1. Рассеките ^3-го возраста личинки, оставляя ЦНС придается кутикулы. Место в 1,5 мл трубки.
2. Зафиксируем в PBS (1x), содержащий 2% формальдегида в течение 40 мин с качалки. ; Использование 250ul за каждые 5-10 расчлененный ЦНС.
3. Удалить формальдегида и кратко промыть 3 раза PBS + 0,1% Тритон Х-100 (PBST). Используйте мелко вытащил пипетки Пастера, чтобы избежать потери ткани.
4. Блок неспецифический белок сайты связывания и permeabilize клеточных мембран путем инкубации ткани 1-8 часов в PBST + 5% BSA, покачиваясь при 4 ° C.
5. Инкубируйте в первичных антител разводят в PBST + 5% BSA качалке при температуре 4 ° С в течение ночи. Оптимальное разведения антител будет варьироваться для разных антител.
6. Промыть 3 раза в PBST с последующими двумя 30 минут моет при температуре 4 ° C.
7. Инкубируйте в вторичными антителами разводят в PBST + 5% БСА в течение 1-3 часов качания при 4 ° C. Промыть 3 раза в PBST с последующими двумя 30 минут моет при температуре 4 ° C. Если вторичный сопряжена с светочувствительных соединений, оберните трубу в алюминиевую фольгу.
8. Рассеките ткани в дальнейшем (при необходимости) и установите на слайдах.

Discussion

Это видео демонстрирует, как вскрыть ЦНС из третьих личинки дрозофилы возраста. После вскрытия, ЦНС могут быть окрашены с использованием стандартного протокола иммуногистохимии. В настоящее время, многое до сих пор неизвестно о том, как взрослые нервной системы создается, а также как он хранит и передает информацию. Исследования развивающихся дрозофилы ЦНС личиночной должны расширить наши знания о нервная система электропроводки и функции.

Личинки дрозофилы обладают рядом stereotpyed поведения, таких как ответ на сигналами окружающей среды. Как такое поведение уроки и хранится в нервной системе? Исследования нервной системы во время развития личинок поможет ответить на этот вопрос.

На данном этапе развития у дрозофилы, организм готовится пройти огромные морфологические изменения, которые происходят во время окукливания. За это время, массивные реконструкции нервно-мышечной системы происходит как organsim переходы из ползком личинки во взрослую особь летать. Это будет интересно, чтобы определить, как нейроны меняться в течение этой стадии развития, и если тот же тип поведения можно наблюдать в нейронах высших животных.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Forceps	fine tipped
9-well Watch glass
Plastic Petri dish