Dissection z larw CNS na Drosophila melanogaster

Summary

W tym artykule pokazujemy, jak wnikliwie ośrodkowego układu nerwowego z państw larw Drosophila stadium.

Abstract

Ośrodkowego układu nerwowego (CNS) larw Drosophila jest złożone i słabo rozumiane. Jednym ze sposobów zbadania CNS jest użycie immunohistochemiczne badanie ekspresji różnych powieści i białka znacznika. Barwienie całego larw jest niepraktyczne, ponieważ twardy naskórek zapobiega przenikaniu przeciwciał wewnątrz jamy ciała. W celu plamy tych tkanek należy wnikliwie zwierząt przed układaniem i przebarwienia. W tym artykule pokazujemy, jak wnikliwie larwy muszki owocowej bez uszkodzenia OUN. Zacznij od rozdarcia larwa na pół parę drobnych szczypiec, a następnie włącz naskórka "inside-out", aby odsłonić CNS. Jeśli rozwarstwienie jest wykonywane dokładnie CNS pozostanie podłączony do naskórka. Zwykle utrzymanie CNS dołączone do naskórka na całym utrwalania i barwienia kroki i tylko całkowicie usunąć CNS z naskórka tuż przed zamontowaniem próbki na szkiełku. Pokazujemy także kilka reprezentatywnych obrazów larw CNS barwione z Ewą, czynnik transkrypcyjny wyrażone w podgrupie neuronów w OUN. Artykuł kończy się omówieniem niektórych praktycznych zastosowań tej techniki i potencjalne trudności, które mogą powstać.

Protocol

1. Dissect 3 larwy ^III stadium, pozostawiając CNS dołączone do naskórka. Miejsce w 1,5 ml probówce.
2. Fix w PBS (1x) zawierający 2% formaldehydu do 40 min z biegunach. ; Użyj 250ul za co 5-10 CNS rozcięta.
3. Usuń formaldehydu i krótko przemyć 3 razy PBS + 0,1% Triton X-100 (PBST). Użyj drobno wyciągnął pipety Pasteura, aby uniknąć utraty tkanki.
4. Blok niespecyficzne białka wiążącego strony i permeabilize błon komórkowych przez inkubację tkanki 08/01 godzin w PBST + 5% BSA, kołysanie w temperaturze 4 ° C.
5. Inkubować w pierwszym przeciwciałem rozcieńczony w PBST + 5% BSA kołysanie w temperaturze 4 ° C przez noc. Optymalnego rozcieńczenia przeciwciał będzie różny dla różnych przeciwciał.
6. Spłukać 3x w PBST przez dwie 30min zmywa w temperaturze 4 ° C.
7. Inkubować w drugim przeciwciałem rozcieńczony w PBST + 5% BSA na 1-3 godziny kołysania w 4 ° C. Spłukać 3x w PBST przez dwie 30min zmywa w temperaturze 4 ° C. Jeśli drugi jest sprzężony wrażliwy na światło związek, zawinąć w folię aluminiową rurę.
8. Dissect tkanki dalej (w razie potrzeby) i zamontować na slajdach.

Discussion

Ten film pokazuje, jak wnikliwie CNS z państw larw Drosophila stadium. Po sekcji zwłok, OUN może być barwiony przy użyciu standardowego protokołu immunohistochemiczne. Obecnie wiele jest jeszcze znany, jak dla dorosłych układu nerwowego jest generowany, a także w jaki sposób przechowuje i przesyła informacje. Badania rozwoju Drosophila CNS larwy powinny poszerzyć naszą wiedzę na okablowanie systemu nerwowego i funkcji.

Larw Drosophila wykazują szereg stereotpyed zachowania, takie jak reakcja na bodźce środowiska. Jak dowiedział się tych zachowań i przechowywane w układzie nerwowym? Badania układu nerwowego w trakcie rozwoju larwalnego pomoże odpowiedzieć na to pytanie.

Na tym etapie rozwoju Drosophila, organizm przygotowuje się do poddania się ogromne zmiany morfologiczne, które występują podczas przepoczwarzenie. W tym czasie ogromne przebudowy układu nerwowo-mięśniowego występuje jako organsim przejścia z maggot wpełza dorosłych latać. To będzie interesujące, aby określić jak neurony zmiany na tym etapie rozwoju, a jeśli ten sam typ zachowania można zaobserwować w neuronach wyższych zwierząt.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Forceps	fine tipped
9-well Watch glass
Plastic Petri dish