ЭС клетки человека: начиная культуры из замороженных клеток

Summary

Здесь показано, как в нашей лаборатории начинается оттенки человеческих эмбриональных стволовых клеточной линии культуры из замороженного запаса.

Abstract

Здесь показано, как в нашей лаборатории начинается оттенки человеческих эмбриональных стволовых клеточной линии культуры из замороженного запаса. Во-первых, 1:59 дневных десять см пластины приблизительно один (два) миллиона облученных мышиных эмбриональных фибробластов фидерные клетки промывают оттенков СМИ, чтобы удалить остатки сыворотки и сотовых мусора, а затем добавил оттенки СМИ и оставил, чтобы уравновесить в клетке культуры инкубатора. Замороженный флакон клеток от долгосрочного хранения в жидком азоте или-80C морозильник был добыт и быстро погружается в ванну воды 37С для быстрого оттаивания. Ячейки в замораживании средств массовой информации удаляют из флакона и помещен в большом объеме оттенков СМИ. Большой объем оттенков СМИ облегчает удаление лишней сыворотки и ДМСО, который может вызвать оттенки человеческих эмбриональных стволовых клеток дифференцироваться. Клетки осторожно вышла из-под подвеску, а затем вновь приостановлено в небольшом объеме свежих СМИ оттенков, которые затем используются для семян MEF пластины. Это считается важным для семян MEF пластину, осторожно добавить оттенки клетки в капле мудрый модой чтобы равномерно рассредоточить их по всему пластины. Вновь созданных оттенков культуры пластина возвращается в инкубаторе в течение 48 часов до средств массовой информации заменяется, а затем подается каждые 24 часа после этого.

Protocol

Оттепель из замороженных складе:

1. Перед оттаиванием оттенков клетки, убедитесь, что пластины MEF вы уже подготовили должным образом покрытие в хорошем состоянии. НЕ пытайтесь использовать меньше, чем желательно пластинку, или тот, который старше, чем три дня. Рекомендуется предварительно маркировать все конических труб и колодцев используется.
   
   
2. Предварительно теплых оттенков средствах массовой информации до 37 ° C. Алиготе оттенков СМИ в стерильные конические трубки для каждой линии. Удалить оттенков флакон / с от -80 и сразу же погрузить нижнюю часть трубки в 37 ° С водяной бане. Это должно занять около 45-60 секунд, прежде чем клетки 80% талой (малая часть замороженных слева).
   
   
3. Быстро довести трубку ламинарном боксе, спрей вниз с 70% спиртом и аккуратно переводить клетки предварительно нагревается СМИ. Спиновые трубку, удалить средства массовой информации, и ресуспендируют в соответствующий объем свежей, подогретого оттенков СМИ.
   
   
4. Аспирацию с MEF средств массовой информации из многих скважин, как вы будете оттаивания в. Быстро, аликвоту подогретого оттенков СМИ обратно в каждую лунку пластины, стараясь не мешать прилагается MEFs. Установите пластину в сторону в капюшон. Как и MEFs, лучшие результаты получаются, если капли равномерно распределены по тарелке. Осторожно вернуть пластину 37 ° С инкубатор ночь, чтобы оттенки клетки семенных MEFs. Изменение среды ~ 48 часов после оттепели, заменяя со свежими СМИ оттенков.

Discussion

В этом видеоролике мы покажем, как наша лаборатория регулярно устанавливает оттенки человеческих стволовых эмбриональных клеточных культур из замороженного запаса. Этот процесс поддается для общего использования с любыми клетка млекопитающего, если замороженные в растворе ДМСО. Эффективное оттаивания имеет важное значение для создания новой культуры оттенков клетки из замороженного запаса, и имеет важное значение для экспериментальной консистенции.

Materials

HuES media 651.5 ml KO-DMEM 500 ml PenStrep 6.5 mL Glutamin 6.5 ml NEAA 6.5 mlbeta-mercapt–thanol 0.5 µl KO Serum Replacement 65 ml Plasmanate 65 mL bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml