Człowieka komórek ES: Kultura Od mrożone komórki

Summary

Tutaj pokazujemy, jak w naszym laboratorium rozpoczyna odcienie ludzkich zarodkowych komórek macierzystych kultury linii mrożonych ręki.

Abstract

Tutaj pokazujemy, jak w naszym laboratorium rozpoczyna odcienie ludzkich zarodkowych komórek macierzystych kultury linii mrożonych ręki. Po pierwsze, 01:59 dniowych dziesięć płyty cm około jednego (dwóch) milionów napromieniowanych myszy embrionalnych komórek podajnik fibroblastów przepłukuje się barwy mediów w celu usunięcia resztek surowicy i resztek komórek, a następnie dodaje barwy mediów i lewo do równowagi w komórce kultury inkubatorze. Zamrożone fiolki komórek z długotrwałego przechowywania ciekłego azotu lub-80C zamrażarka pochodzi i szybko zanurza się w kąpieli wodnej 37C do szybkiego rozmrażania. Komórki w zabezpieczeniu media są następnie usunąć z fiolki i umieszczone w dużej ilości odcieni media. Znaczna ilość odcieni mediów ułatwia usuwanie nadmiaru surowicy i DMSO, co może powodować odcienie ludzkich zarodkowych komórek macierzystych do różnicowania. Komórki są lekko wymknęła się spod zawieszenia, a następnie ponownie zawieszono w niewielkiej ilości świeżych barw materiałów, które są następnie wykorzystywane do materiału siewnego płyty MEF. To jest ważne do materiału siewnego płyty MEF, delikatnie dodając barwy komórek w kropli sposób mądry równomiernego rozmieszczenia ich w całej płyty. Nowo powstała kultura barwy płyta jest powrotem do inkubatora 48 godzin przed mediami otrzymuje, a następnie podaje się co 24 godziny później.

Protocol

Odwilż z mrożonych magazynie:

1. Przed rozmrażania barwy komórek, zapewnia, że płyta MEF już przygotowany prawidłowo i chromowana w dobrym stanie. NIE próbuj użyć mniej niż pożądana płyta, lub taki, który jest starszy niż trzy dni. Zaleca się przed etykietą wszystkie stożkowe rury i studnie używane.
   
   
2. Pre-ciepłe barwy mediów do 37 ° C. Mediów barwy porcję do sterylnej probówce stożkowej dla każdej linii. Usuń barwy fiolki / s od -80 i natychmiast zanurzyć się w dolnej połowie rurkę w łaźni wodnej 37 ° C. To powinno zająć około 45-60 sekund przed komórek 80% rozmrożone (małe mrożone lewej części).
   
   
3. Szybko doprowadzić rury do okapu przepływ laminarny, spray w dół z 70% alkoholem i delikatnie przeniesienie komórek do mediów ogrzana. Spin rurki, wyjmij media, i zawiesić w odpowiedniej ilości świeżego, ogrzana barwy mediów.
   
   
4. Aspirować off MEF mediów z tak wielu studni, jak będziesz rozmrażanie w. Szybko, porcję ogrzana barwy mediów z powrotem do każdej studzienki płytki, uważając, aby nie przeszkadzać załączonym MEFs. Ustaw płytę na bok w kapturze. Tak jak w MEFs, najlepsze wyniki uzyskuje się, jeżeli krople są równomiernie rozłożone na temat płyty. Ostrożnie płytkę do 37 ° C w inkubatorze na noc, aby umożliwić barwy komórek do materiału siewnego MEFs. Zmień mediów ~ 48 godzin po odwilży, zastępując świeże barwy mediów.

Discussion

W tym filmie pokażemy, jak nasze laboratorium rutynowo ustanawia odcienie ludzkich macierzystych komórek embrionalnych kultury z zamrożonych zapasów. Proces ten jest podatny do ogólnego użytku z każdą komórką ssaka, jeśli zamrożone w roztworze DMSO. Efektywne rozmrażanie jest niezbędne do utworzenia nowej kultury barwy komórek z zamrożonych zapasów, i jest ważne dla spójności eksperymentalnych.

Materials

HuES media 651.5 ml KO-DMEM 500 ml PenStrep 6.5 mL Glutamin 6.5 ml NEAA 6.5 mlbeta-mercapt–thanol 0.5 µl KO Serum Replacement 65 ml Plasmanate 65 mL bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml