冷凍細胞から出発培養：ヒトES細胞

Summary

ここでは私たちの研究室は、凍結ストックからの色相ヒト胚性幹細胞株の培養を開始する方法を示します。

Abstract

ここでは私たちの研究室は、凍結ストックからの色相ヒト胚性幹細胞株の培養を開始する方法を示します。最初に、約（2〜）百照射したマウス胚性線維芽細胞のフィーダー細胞の1〜2日齢10センチメートル板が残存血清や細胞破片を除去するために色相のメディアでリンスし、色相のメディアが追加され、細胞内で平衡に委ねられている培養インキュベーター。冷凍長期液体窒素貯蔵から細胞のバイアルまたは- 80C冷凍庫がソースと素早く解凍迅速にするための37C水浴に浸漬される。凍結培地中の細胞は、バイアルから削除され、色相のメディアの大ボリュームに配置されます。色相の大ボリュームは、メディアは色相ヒト胚性幹細胞が分化する原因となる過剰な血清及びDMSOの除去を容易にします。細胞を穏やかにしてシードMEFのプレートをするために使用される新鮮な色合いのメディアの小さなボリュームに再懸濁した懸濁液から分離独立、とされています。それを穏やかに均等にプレートを通してそれらを分散させる滴下方法で色相のセルを追加することにより、MEFプレートシードに重要であると考えています。メディアを交換する前に新しく設立された色合いの培養プレートを48時間インキュベーターに戻され、その後、その後24時間ごとに供給されます。

Protocol

凍結ストックからの雪解け：

1. 色相の細胞を解凍する前に、既に準備したMEFのプレートが良好な状態で適切にメッキしていることを確認してください。望ましい板、または3日前より古い場合よりも少ないを使用しないでください。それはすべてのコニカルチューブや井戸が使用されて事前にラベルを付けることをお勧めします。
   
   
2. 37℃に予熱する色合いのメディア各ラインのための滅菌コニカルチューブに分注し色合いのメディアを。 -80〜バイアル/ sの色合いを削除し、直ちに37℃の水浴中に浸し、チューブの下半分を。細胞が80％（左の小さな冷凍部分）に解凍する前に、これは45〜60秒ほどかかります。
   
   
3. 迅速に、層流フードへのチューブをもたらす70％アルコールでダウンスプレー、と優しく予め温めておいたメディアのために細胞を移す。チューブをスピン、メディアを取り出し、そして新鮮な、予め温めておいた色合いのメディアの適切な量で再懸濁します。
   
   
4. あなたがに解凍されるので、多くの井戸などからMEFメディアをオフに吸引除去する。バックプレートの各ウェルに迅速に、一定分量予め温めておいたHues社のメディア、添付のMEFを乱さないように注意して。フード内でわきプレートを設定します。滴は均等にプレートに分布している場合はMEFの場合と同様に、最良の結果が得られる。種子への色合いの細胞はMEFを可能にするために一晩37℃のインキュベーターにプレートを慎重にして返す。新鮮な色合いのメディアと交換する、〜48時間解凍した後、メディアを変更します。

Discussion

このビデオでは、我々の研究室では日常的に凍結ストックから色相ヒト胚性幹細胞培養を確立する方法を示します。このプロセスは、DMSO溶液中で凍結した場合は任意の哺乳動物細胞で一般的な使用に適している。効率的な融解は凍結ストックから色相細胞の新たな文化を確立するために不可欠であり、実験的な一貫性を保つために重要です。

Materials

HuES media 651.5 ml KO-DMEM 500 ml PenStrep 6.5 mL Glutamin 6.5 ml NEAA 6.5 mlbeta-mercapt–thanol 0.5 µl KO Serum Replacement 65 ml Plasmanate 65 mL bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml