Summary
在这里，我们证明，我们的实验室如何从冻结的股票开始一个色调的人类胚胎干细胞线文化。
Abstract
在这里，我们证明，我们的实验室如何从冻结的股票开始一个色调的人类胚胎干细胞线文化。首先，一到两个大约10厘米板（两个）万元照射的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层细胞与色调媒体冲洗以去除残留的血清和细胞碎片，然后色调媒体和左在细胞内平衡培养。一个长期的液态氮储存或A - 80C冷冻细胞冷冻小瓶来源，并迅速淹没37C水浴中快速解冻的。在冻结媒体的细胞，然后从小瓶中删除，并放入大量的色调媒体。大量的色调媒体有助于去除多余的血清和DMSO，这可能会导致色调人类胚胎干细胞分化。悬浮细胞轻轻地分离出来，然后重新悬浮在一个体积小，新鲜的色彩，然后用种子的MEF板媒体。它被认为是重要的种子的MEF板轻轻下拉明智的方式加入的色调细胞均匀地分散在整个板块。新成立的色调培养板孵化器的媒体取代之前48小时内返回，然后是美联储此后每隔24小时。
Protocol
从冻结的股票解冻：
- 在解冻色调细胞之前，请确保您已经做好准备，MEF板是正确镀状况良好。 不要尝试用一个较理想的板，或者是3天以上 。 建议前所有锥形管和井正在使用的标签 。
- 预暖色调媒体至37 ° C。分装的色调媒体的无菌锥形管中的每一行。删除色调从-80瓶/ S，立即浸泡在37℃水浴管的下半部分。细胞解冻80％（左小冻结部分）之前，需要大约45-60秒。
- 迅速地把管层流罩，喷以70％酒精，轻轻转移细胞预热媒体。旋转管，删除媒体，并重新悬浮在新鲜，预热色调媒体适当的音量。
- 许多水井，你将解冻到吸了MEF媒体。很快，等分预热色调媒体以及到每个板块，小心不要去打扰附加MEFs。除了在引擎盖的板块设置。至于与MEFs，获得最好的结果是，如果下降是均匀分布在板的。小心地返回板块37 ° C培养箱中过夜，让种子细胞的色调的MEFs。更改媒体解冻〜48小时后，更换新鲜的色彩与媒体的。
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Discussion
在这段视频中，我们将展示我们的实验室如何经常从冻结的股票建立一个色调的人类胚胎干细胞培养。这个过程是适合一般使用任何哺乳动物的细胞，如果在DMSO溶液冷冻。高效解冻是必不可少的，建立一个新的文化色调从冻结的股票细胞和实验的一致性很重要。
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Materials
| HuES media 651.5 ml KO-DMEM 500 ml PenStrep 6.5 mL Glutamin 6.5 ml NEAA 6.5 mlbeta-mercapt–thanol 0.5 µl KO Serum Replacement 65 ml Plasmanate 65 mL bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml |
References
- Cowan, C. A. Derivation of Embryonic Stem Cells from Human Blastocysts. , 1650-1656 (2004).
