Menselijke ES-cellen: Vanaf Cultuur van bevroren cellen

Summary

Hier laten we zien hoe onze lab een TINTEN menselijke embryonale stamcellen lijn cultuur begint met een bevroren voorraad.

Abstract

Hier laten we zien hoe onze lab een TINTEN menselijke embryonale stamcellen lijn cultuur begint met een bevroren voorraad. Ten eerste is een tot twee dagen oud tien cm plaat van ongeveer een (tot twee) miljoen bestraald muis embryonale fibroblasten feeder-cellen gespoeld met tinten media om resterende serum en cellen vuil te verwijderen, en vervolgens TINTEN media toegevoegd en links naar evenwicht in de cel cultuur incubator. Een bevroren flacon van cellen van lange termijn opslag van vloeibare stikstof of een-80C vriezer is afkomstig en snel ondergedompeld in een 37C waterbad voor snel ontdooien. Cellen in de vrieskou media worden vervolgens verwijderd uit de flacon en geplaatst in een groot volume van tinten media. Het grote volume van kleuren media vergemakkelijkt het verwijderen van overtollige serum en DMSO, wat kan leiden tot TINTEN menselijke embryonale stamcellen om te differentiëren. Cellen zijn zacht gesponnen uit de vering, en vervolgens opnieuw gesuspendeerd in een klein volume van verse TINTEN media die vervolgens wordt gebruikt om het zaad van de MEF plaat. Het wordt belangrijk geacht om het zaad van de MEF plaat door voorzichtig toe te voegen de tinten cellen in een druppelsgewijs manier om gelijkmatig te verspreiden in de hele plaat. De onlangs opgerichte TINTEN cultuur plaat terug naar de incubator voor 48 uur voor de media wordt vervangen, wordt vervolgens elke 24 uur daarna.

Protocol

Ontdooi een bevroren voorraad:

1. Voordat ontdooien TINTEN cellen, ervoor zorgen dat de MEF plaat die je al hebt voorbereid correct is verguld en in goede conditie. Probeer NIET een minder dan wenselijk plaat, of een die ouder is dan drie dagen te gebruiken. Het wordt aanbevolen om pre-label alle conische buizen en putten worden gebruikt.
   
   
2. Pre-warme tinten media tot 37 ° C. Aliquot TINTEN media in een steriele conische buis voor elke lijn. Verwijder TINTEN flacon / s van -80 en onmiddellijk onder water de onderste helft van de buis in een 37 ° C waterbad. Het duurt ongeveer 45-60 seconden voordat de cellen zijn 80% ontdooid (klein links diepvries gedeelte).
   
   
3. Snel de buis te brengen om de laminaire flow kap, spray neer met 70% alcohol, en zachtjes cellen over te dragen aan de van de voorverwarmde media. Draai de buis, verwijder de media, en resuspendeer in een geschikt volume van verse, voorverwarmde TINTEN media.
   
   
4. Aspireren uit de MEF media van zoveel putten als je wordt ontdooien in. Snel, aliquot voorverwarmde TINTEN media terug in elk putje van de plaat, zorg dat u de bijgevoegde MEFs verstoren. Zet de plaat in de motorkap. Net als bij MEF, zijn beste resultaat verkregen als de druppels zijn gelijkmatig verdeeld over de plaat. Voorzichtig de plaat 's nachts terug te keren naar een 37 ° C incubator, zodat de tinten cellen om het zaad van de MEFs. Verandering media ~ 48 uur na ontdooien, ter vervanging van verse TINTEN media.

Discussion

In deze video laten we zien hoe ons laboratorium routinematig een TINTEN menselijke embryonale stamcellen cultuur voorziet van een bevroren voorraad. Dit proces is vatbaar voor algemeen gebruik met een zoogdiercellen als bevroren in een DMSO oplossing. Efficiënte ontdooien is essentieel voor de oprichting van een nieuwe cultuur van tinten cellen van een ingevroren voorraad, en is belangrijk voor experimentele consistentie.

Materials

HuES media 651.5 ml KO-DMEM 500 ml PenStrep 6.5 mL Glutamin 6.5 ml NEAA 6.5 mlbeta-mercapt–thanol 0.5 µl KO Serum Replacement 65 ml Plasmanate 65 mL bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml