Humane ES-Zellen: Starting Kultur aus eingefrorenen Zellen

Summary

Hier zeigen wir, wie unser Labor eine FARBEN menschliche embryonale Stammzell-Linie Kultur beginnt aus einem gefrorenen Lager.

Abstract

Hier zeigen wir, wie unser Labor eine FARBEN menschliche embryonale Stammzell-Linie Kultur beginnt aus einem gefrorenen Lager. Zunächst wird eine 1-2 Tage alte zehn cm Platte von etwa einer (zwei) Millionen bestrahlt embryonalen Maus-Fibroblasten-Feeder-Zellen mit Farben Medien gespült, um restliche Serum und Zelltrümmer zu entfernen, und dann FARBEN Medien hinzugefügt und links in der Zelle ausgleichen Inkubator. Eine gefrorene Röhrchen von Zellen aus langfristigen flüssigem Stickstoff Lagerung oder a-80C Gefrierschrank ist bezogen und schnell unter Wasser in einem 37C Wasserbad für schnelles Auftauen. Die Zellen in dem Gefrierpunkt Medien werden dann aus dem Fläschchen entnommen und in einem großen Volumen von Farbtönen Medien. Das große Volumen von Farbtönen Medien erleichtert die Entfernung von überschüssigem Serum und DMSO, die dazu führen FARBEN humanen embryonalen Stammzellen zu differenzieren können. Die Zellen werden vorsichtig aus der Suspension gesponnen und dann in eine kleine Menge frischer FARBEN Medien, die dann verwendet wird, um Samen der MEF Platte resuspendiert. Es wird als wichtig angesehen, um Samen der MEF Platte durch vorsichtiges Hinzufügen die Farbtöne Zellen in einem tropfenweise Mode gleichmäßig verteilen sie in der gesamten Platte. Die neu gegründete FARBEN Kulturplatte in den Inkubator ist für 48 Uhr zurückgegeben werden, bevor Medien ersetzt wird, wird dann alle 24 Stunden danach zugeführt.

Protocol

Tauwetter aus einem gefrorenen Lager:

1. Vor dem Auftauen FARBEN Zellen, sicherzustellen, dass die MEF Platte Sie bereits vorbereitet haben, richtig ist verzinkt und in gutem Zustand. NICHT versuchen, eine weniger als wünschenswert Platte, oder eine, die älter als drei Tage zu verwenden. Es ist vor-label alle konischen Rohren und Brunnen genutzt empfohlen.
   
   
2. Pre-warmen Farbtönen Medien bis 37 ° C. Aliquot FARBEN Medien in einem sterilen konischen Rohr für jede Zeile. Entfernen FARBEN Fläschchen / s von -80 und sofort tauchen in der unteren Hälfte des Rohres in einem 37 ° C Wasserbad. Es sollte etwa 45-60 Sekunden dauern, bevor die Zellen 80% aufgetaut (kleine gefrorene Teil links).
   
   
3. Bringt schnell das Rohr auf die Laminarströmungshaube, abspritzen mit 70% Alkohol und sanft Transfer-Zellen, die von vorgewärmten Medien. Drehen Sie das Rohr zu entfernen Medien und resuspendieren in einem geeigneten Volumen von frischem, vorgewärmten FARBEN Medien.
   
   
4. Absaugen des MEF Medien aus möglichst vielen Quellen, wie Sie in dem Auftauen werden. Schnell wird aliquoten vorgewärmten FARBEN Medien wieder in jede Vertiefung der Platte vorsichtig auf die beigefügte MEFs stören. Stellen Sie den Teller zur Seite in der Motorhaube. Wie bei MEFs werden die besten Ergebnisse erzielt, wenn die Tropfen gleichmäßig über die Platte verteilt sind. Vorsichtig wieder die Platte um 37 ° C Inkubator über Nacht, damit die Farbtöne Zellen Samen der MEFs. Ändern Medien ~ 48 Stunden nach dem Auftauen und ersetzt mit frischen FARBEN Medien.

Discussion

In diesem Video zeigen wir, wie unser Labor routinemäßig stellt eine FARBEN menschlichen embryonalen Stammzellen Kultur aus einem gefrorenen Lager. Dieser Prozess ist zugänglich für die allgemeine Verwendung mit jedem Säugetier-Zelle, wenn in einer DMSO-Lösung eingefroren. Effiziente Auftauen ist wichtig für den Aufbau einer neuen Kultur von Farbtönen Zellen aus einem gefrorenen Lager und wird für die experimentelle Konsistenz wichtig.

Materials

HuES media 651.5 ml KO-DMEM 500 ml PenStrep 6.5 mL Glutamin 6.5 ml NEAA 6.5 mlbeta-mercapt–thanol 0.5 µl KO Serum Replacement 65 ml Plasmanate 65 mL bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml