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Biology

시그마의 비 특정 프로 테아제의 활동 분석 - 카제인 기판으로

doi: 10.3791/899 Published: September 17, 2008

Summary

프로 테아제는 펩티드 채권을 깰. 연구실에서, 그것은 종종 프로 테아제의 활동을 측정 및 / 또는 비교하는 것이 필요합니다. 시그마의 불특정 프로 테아제 활동 분석은 프로 테아제의 활동을 결정하는 표준화된 절차로 사용할 수 있습니다.

Abstract

프로 테아제는 펩티드 채권을 깰. 연구실에서, 그것은 종종 프로 테아제의 활동을 측정 및 / 또는 비교하는 것이 필요합니다. 시그마의 불특정 프로 테아제 활동 분석은 우리의 품질 관리 절차 동안 어떤 일을 프로 테아제의 활동을 결정하는 표준화된 절차로 사용할 수 있습니다. 이 분석에서는 카제인은 기판 역할을합니다. 우리가 테스트하는 프로 테아제가 카제인 소화되면 아미노산 티로신은 다른 아미노산과 펩타이드 조각과 함께 해방됩니다. Folin 및 Ciocalteus 페놀, 또는 Folin의 시약은 주로 같지는와 분광 광도계에 흡광도 값으로 측정하는 파란 색깔의 발색단를 생산하는 무료 티로신과 반응. 카제인에서 릴리스 더 티로신, 더 chromophores이 프로 테아제의 활동을 생성하고 강한입니다. 단백 분해 효소의 활동에 의해 생성된 흡광도 값 micromoles에서 티로신의 양을와 흡광도의 변화를 상호 연관시킬 FC 시약과 티로신 알려진 수량 반응에 의해 생성된 표준 곡선에 비교됩니다. 표준 곡선에서 프로 테아제 샘플의 활동은 분당 카제인에서 출시 티로신 등가물의 micromoles에서 금액 단위의 측면에서 결정 수 있습니다.

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Protocol

분석을 시작하기 전에, 우리는 다음의 시약이 올바르게 준비되었는지 확인해야합니다 :

  1. 50 MM의 칼륨 인산 버퍼, 산도 7.5. 11.4 MG / 칼륨 phospate 이염, 물을 정화하고 1M HCL과 산도를 조정에 trihydrate의 ML을 사용하여 준비합니다. 이 솔루션은 사용하기 전에 ° C 37 배치됩니다.
  2. 50 MM의 칼륨 인산 버퍼에 카제인의 6.5 MG / ML을 혼합하여 준비 0.65 % 중량 / 부피 카제인 솔루션. 점차적 ° C 10 분 정도 동질적인 분산이 이루어 때까지 80-85로 부드러운 감동과 솔루션 온도를 증가. 이 솔루션을 끓여서하지 않는 것이 매우 중요합니다. NaOH와 HCL와 함께 필요한 경우 산도 그런 다음 조정됩니다.
  3. 물을 정화와 6.1N 재고 1시 55분을 diluting하여 준비 110 MM Trichloroacetic 산성 용액. Trichloroacetic의 산성이 강한 산성이며 유의해서 다루어 져야합니다.
  4. 0.5 MM Folin & Ciolcaltea의, 또는 직접적으로 프로 테아제의 활동과 관련이있을 것입니다 측정 색 변화를 생성하는 티로신과 반응 솔루션입니다 Folin의 페놀 시약. Folin의 페놀 시약은 산성이며 유의해서 다루어 져야합니다.
  5. 물을 정화에 anyhydrous 나트륨 탄산의 53 MG / ML을 사용 준비 500 MM 나트륨 탄산 솔루션.
    37 5mM 칼슘 아세테이트 10 MM의 아세트산 나트륨 버퍼, 산도 7.5의 효소로 구성되어 희석제 솔루션 ° C. 이 솔루션은 우리가 고체 테아제 샘플을 분해 또는 효소 솔루션을 희석하는 데 사용하는 어떤 것입니다.
  6. 1.1 MM L - 티로신 표준 재고 솔루션입니다. 물을 정화하고 티로신이 해소 때까지 부드럽게 온수 0.2 MG / ML L - 티로신을 사용하여 준비 하였다. 카제인과 마찬가지로이 솔루션을 끓여하지 않습니다. L - 티로신 표준 실온으로 냉각하도록 허용합니다. 이 솔루션은 표준 곡선을 만들기 위해 더욱 희석됩니다.
  7. 단백 분해 효소 솔루션입니다. 사용하기 전에 즉시, 6 단계에서 준비 효소 희석제 솔루션 테아제를 해산.

필요한 경우, 0.1-0.2 단위 / ML하는 효소 희석액을 사용하여 해산합니다 예정된 활동의 견고한 프로 테아제 샘플을 사용합니다. 이 솔루션은 품질 관리 분석에 대한 긍정적인 제어로 우리가 효소 활동을 결정하기 위해 수행되는 계산에 대한 검증 역할을합니다.

단백 분해 효소 분석 및 표준 곡선 설정

  1. 이 분석을 시작하려면 약 15 MLS를 개최합니다 적절한 튜브를 찾으십시오. 테스트 각 효소에 대한 4 튜브가 필요합니다. 한 병에가 빈로 사용되며, 세 사람은 프로 테아제의 세 dilutions의 분석 활동하는 데 사용됩니다. 서로에 대한 최종 계산을 확인할 때 세 dilutions가 유용합니다.
    1. 네 튜브의 각 설정하려면, 우리의 0.65 %의 카제인 솔루션의 5mls를 추가합니다. 그들이 37 물 목욕으로 평형하자 ° C를 약 5 분하십시오.
    2. 공백이 아닌 테스트 샘플 튜브 세 가지로 테스트됩니다 효소 솔루션의 볼륨을 변화하지만, 추가합니다. ° C 정확히 십분을 휘몰아치는 37에 대한 부화하여 섞는다. 이 배양 시간 동안 프로 테아제의 활동과 티로신의 결과적 해방은 측정 및 테스트 샘플 사이에 비교 될거야.
  2. 이 10 분 부화 후, 반응을 중지 각 튜브에 TCA 시약의 5​​ MLS를 추가합니다. 그런 다음, 각 튜브에 심지어 빈, 그래서 각각의 튜브에 효소 용액의 최종 부피가되는 한 ML을 효소 솔루션의 적절한 볼륨을 추가합니다. 이것은 효소 자체의 흡광도 값을 고려하여 각 튜브의 최종 볼륨이 동일한지 확인하는 일을합니다. 37 솔루션을 품어 ° C를 30 분.


    이 30 분 동안 부화, 당신은 티로신 표준 dilutions을 설정할 수 있습니다. 쉽게 팔 MLS를 저장할 수있는 6 DRAM 튜브 (DRAM의 튜브가 폴리 프로필렌 튜브로 대체 수 있습니다)를 사용합니다. 0.05, 0.10, 0.20, 0.40, 0.50 : 여섯 튜브하려면, MLS에서 다음 볼륨으로 1.1 MM 티로신 표준 재고 솔루션을 추가합니다. 빈 어떤 티로신 표준을 추가하지 마십시오. 낮은 표준은 약간의 색상 변화를 얻을 것입니다 불순한 테스트 샘플에 필요한 수 있습니다. 티로신 표준 솔루션이 추가되면, 2 MLS에 볼륨을 가져 기준 각 정화 물을 적절한 볼륨을 추가합니다.
  3. 30 분 부화 후, 테스트 솔루션의 각 필터와 빈이 0.45 음 polyethersulfone 주사기 필터를 사용합니다. 여과는 시료로부터 insolubles를 제​​거하는 데 필요합니다.
    1. 최소한 8 MLS를 저장할 수있는 4 DRAM의 튜브로 여과 2 테스트 샘플의 MLS와 빈 여과물을 추가합니다. 기준가 준비가되어있는 유리병의 동일한 유형을 사용하실 수 있습니다.
    2. 기준 및 표준 공백이 들어있는 유리병 모든, 나트륨 탄산염의 5mls를 추가합니다. 최상의 결과를 얻으려면, 즉시 나중에 Folin의 시약 1 ML를 추가합니다.
    3. Folin의 시약을 추가하여 만든 산도 드롭을 규제하기 위해 나트륨 탄산염을 추가합니다.
    4. 테스트 샘플 드디어으로 나트륨 탄산 추가t 비워. 이러한 솔루션은 나트륨 탄산염의 추가 후 흐림된다. 무료 티로신과 주로 반응 Folin의 시약을 추가합니다.
    5. 소용돌이 치는하여 DRAM의 튜브를 섞어 30 분 동안 37 ° C에서 알을 품다.
    이 부화 후, 당신은 표준 티로신 추가의 금액과 연관 색상의 그라데이션이 있다고 통지해야한다 티로신의 최고 농도는 어두운 게재. 당신은 또한 우리의 테스트 샘플에서 감지할 수있을 정도의 색상 변경을 통지하실 수 있습니다. 이러한 솔루션 2mls는 적합한 cuvettes에 0.45 음 polyethersulfone 주사기 필터를 사용하여 필터링됩니다. 분석이 수행되는 이제, 당신은 우리의 흡광도 값을 기록 분광 광도계로 진행할 수 있습니다.

흡광도를 측정하고 효소 활동을 계산

  1. 샘플의 흡광도는 660nm의 파장을 사용하여 분광 광도계로 측정됩니다. 조명 경로는 1cm로 설정됩니다. 표준, 표준 빈, 다른 시험 샘플 테스트 비워에 대한 흡광도 값을 기록합니다. 일단 모든 데이터가 수집되어, 표준 곡선을 만들 수 있습니다. 표준 및 표준 빈 사이의 흡광도의 곡선을 생성하기 위해 차이는 계산해야합니다. 이것은 표준 솔루션 티로신의 양에 기인 흡광도 값이다. 이 간단한 계산 후, Y 축에 대한 기준 흡광도의 변화, 대 X 축에 대한 다섯 표준의 각 micromoles에 금액을 계획하는 그래프 프로그램을 사용하여 표준 곡선을 만듭니다.

    티로신 표준의 볼륨 uMoles의 티로신
    0.05 0.055
    0.10 0.111
    0.20 0.221
    0.40 0.442
    0.50 0.553
  2. 데이터 포인트가 입력되고 나면, 가장 적합한 및 해당 슬로프 방정식의 라인을 생성합니다.


    테스트 샘플 흡광도 및 테스트 빈의 흡광도의 차이를 계산하여 테스트 샘플의 흡광도 변화를 찾으십시오. 슬로프 방정식에 테스트 샘플 중 하나에 대한 흡광도 값을 삽입 및 해결하면이 특정 proteolytic 반응 동안 티로신 해방의 micromoles가 발생합니다. / ML 당 단위로 효소의 활동을하려면, 다음과 같은 계산을 수행합니다 :


    (umole 티로신 등가물이 발표) X (11)
    단위 / ML 효소 = __________________________________________

    (1) X (10) X (2)


    분석 11 = 총 볼륨 (밀리리터)을
    분석 10 = 시간 (분)을 단위로 정의 당
    한 효소의 효소 = 볼륨 (밀리리터)를 사용
    Colorimetric 결정에 사용되는 2 = 볼륨 (밀리리터)을


    슬로프 방정식에서 얻은 micromoles 티로신 동일한 릴리스의 개수를 가지고 우리의 경우에는 11mls있다 MLS에서 분석의 총 볼륨에 의해 그것을 곱하면됩니다. 세 가지 다른 수량하여이 값을 나누기 : 우리가 10 분 동안 실행된 분석의 시간, 분석에 사용되는 효소의 볼륨은, (가 1ml를 사용하자) 다양한되었던 colorimetric 검출에 사용 밀리리터의 부피, 어떤 수 있습니다 귀하의 쿠베트에 따라 다릅니다. 우리는 MLS 2를 사용합니다.
  3. 티로신의 Micromoles는 "단위"라는 단백 분해 효소 활동의 분 수율 측정 시간으로 나눠 계산합니다. 우리는 단위 / ML의 관점에서 효소 활동의 measurment두고, 분자와 분모의 볼륨 측정 단위를 취소할 수 있습니다. 효소 희석액에 희석 솔리드 프로 테아제 샘플의 활동을 결정하기 위해, 우리는 단위 / MG의 관점에서 활동으로 우리를 떠나지에서 MG / ML. 원래이 분석에 사용되는 고체의 농도에 의해 단위 / ML 우리의 활동을 나누어 .


    단위 / ML 효소
    단위 / MG 고체 = _____________________

    MG 솔리드 / ML 효소

Discussion

우리는 시그마의 보편적인 프로 테아제 활동 분석을 사용하는 프로 테아제 활동을 분석하는 방법을 보여했습니다. 또한,이 분석은 실험을 위해 그들을 받게하기 전에 우리 프로 테아제는 정확하게 활동을 결정했는지 확인하는 데 유용합니다. 당신이 본 것처럼,이 절차를 수행할 때, 그것은 천천히 아니라 그들을 끓일 수있는 카제인과 티로신 솔루션을 모두 열을 기억 파라마운트 중요 하군요. 또한, 둘 다 표준과 당신이 가진 각 테스트 샘플에 대해 서로 다른 공백을 준비하는 매우 중요하다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protease Sigma-Aldrich P4630
Potassium Phosphate, Dibasic, Trihydrate Sigma-Aldrich P5504
Casein Sigma-Aldrich C7078
Trichloroacetic Acid Sigma-Aldrich T0699
Folin & Ciocalteu's Phenol Reagent Sigma-Aldrich F9252
Sodium Carbonate, Anhydrous Sigma-Aldrich S2127
Sodium Acetate, Trihydrate Sigma-Aldrich S8625
Calcium Acetate Sigma-Aldrich C1000
L-Tyrosine, Free Base Sigma-Aldrich T3754
Protease Profiler Kit Sigma-Aldrich PP0500
Protease Fluorescent Detection Kit Sigma-Aldrich PF0100

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References

  1. Anson, M. L. J. Gen. Physiol. 22, 79-89 (1938).
  2. Folin, O., Ciocalteau, V. J. Biol. Chem. 73, 627- (1929).
시그마의 비 특정 프로 테아제의 활동 분석 - 카제인 기판으로
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Cupp-Enyard, C. Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate. J. Vis. Exp. (19), e899, doi:10.3791/899 (2008).More

Cupp-Enyard, C. Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate. J. Vis. Exp. (19), e899, doi:10.3791/899 (2008).

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