Summary
이 비디오는 새로운 문화, 병아리의 배아는 최대 24 시간까지 계란 이외의 양식하는가하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 초기 개발 (14 솜으로 원시적인 승리.) 마우스 E7 - 9에 해당하는 기간 동안 공부를 하나 있습니다. 이 기술의 응용은 현장 하이브리드화과 immunohistochemistry에 electroporation을 포함합니다.
Abstract
여자의 난자는 초기 배아 발달의 연구에 귀중한 도구입니다. 투명성, 접근성 및 조작 용이성, 그건 뇌, 신경 튜브, 체절과 심장 primordia의 형성과 patterning을 공부를위한 이상적인 도구가합니다. 여자는 배아 문화의 응용 프로그램은 현장 하이브리드화과 immunohistochemistry의 유전자 기능 등 FGFs 및 BMPs와 같은 성장 인자 코팅 구슬 이식뿐만 아니라 전체 마운트를 분석하기 위해 DNA 또는 RNA 구조의 electroporation을 포함합니다. 이 비디오는 여자의 배아 문화의 여러 단계를 보여주는, 첫째, 배아는 호수에 explanted 있습니다. 그런 다음, 배 (胚)는 유리 반지를 중심으로합니다. 배아를 둘러싼 세포막은 반지의 벽면을 따라 해제됩니다. 반지는 다음 albumine의 수영장이 포함된 문화 접시에 배치됩니다. 배아는 최대 24 시간까지 교양있는 곳을 문화 요리는 밀봉하여 습기가 실내에 배치됩니다. 마지막으로, 배아는 반지에서 제거 고정 더욱 응용 프로그램에 처리됩니다. 문제 해결 가이드도 제공됩니다.
Protocol
1 부 : 벤치 설정
- 습기 챔버는 플라스틱 챔버에 Kimwipe / ddH 2 O을 삽입하여 준비가되어 있습니다.
- 문화, 반지, watchglass 및 폐기물 처리에 대한 알부민, 요리를 수집하는 팰컨 튜브는 벤치에 게재됩니다.
- Pyrex 요리는 1.4 리터의 호수 가득 (노트를 참조하십시오 [A]).입니다
2 부 : 배아 호수에 explanted입니다
- 계란 16 시간 (4 단계) 후 인큐베이터에서 제거됩니다. 계란은 집게로 껍질을 감청하여 opene 있습니다. 셸 조각이 제거됩니다.
- 얇은 알부민은 팔콘 튜브에 수집됩니다. 굵은 알부민은 집게로 제거됩니다.
- 배아는 생리 접시 안에 플라스틱 접시에 배치됩니다. 나머지 알부민은 집게로 제거됩니다.
파트 3 : 배아 반지에 중심
- 그 배가 위쪽으로 얼굴 때문에 난황은 집게로 기울어져있다.
- 난황은 적도 수준 또는 아래의 절단이다.
- 좋은 집게를 사용하여 vitelline 막이 신속하게 벗겨 수 있습니다. vitelline 막은 그 세분화된 측면 (비 시니)가 이상 얼굴 너무 지향합니다.
- 고급 집게를 사용하여 vitelline 막이 시계 유리에 배치됩니다.
- 고급 집게를 사용하여 유리 반지가 vitelline 막 위에 적용되고 배아가 중심이다.
- vitelline 막는 유리 반지의 가장자리 주위에 해제합니다. 조립은 살린 요리에서 제거됩니다.
4 부 : 문화 현미경으로 설정되어
- vitelline 막는 현미경 미세 집게를 사용하여 유리 반지를 통해 해제됩니다.
- 파스퇴르 피펫을 사용하여 호수는 반지의 바깥쪽 가장자리에서 제거됩니다.
- 좋은 가위를 사용하여 초과 vitelline 막는 유리 반지의 안쪽 가장자리에서 제거됩니다. 관리는하지 피펫이나 집게로 막을 피어스로 이동합니다.
- 배아는 부드럽게 풀어 세포막과 노른자의 세포를 제거하는 식염수에 씻어서 있습니다.
- 200 μl 호수는 반지 (이것은 나중에 전송을 용이하게합니다)의 바깥쪽 가장자리에 추가됩니다.
- 어셈블리가 거꾸로 플라스틱 접시로 덮여 있습니다.
제 5 부 : 문화 인큐베이터로 전송됩니다
- 팰컨 문화 요리가 표시됩니다.
- 얇은 알부민의 2.5ml은 팰컨 접시의 바닥에 추가됩니다.
- 얇은 알부민의 200μl는 팰컨 접시의 뚜껑의 안쪽 가장자리에 추가됩니다.
- 거꾸로 요리는 어셈블리에서 제거됩니다.
- 좋은 집게를 사용하여 유리 반지 시계 유리의 가장자리를 따라 slided 및 팰컨 요리로 전송됩니다.
- 모든 남아있는 호수는 반지의 안쪽 표면에서 제거됩니다.
- 팰컨 요리는 덮개로 덮여과 봉인이다.
- 조립은 습기 챔버에서 다음 인큐베이터에 배치됩니다.
- 배아는 38 ° C.에 24 시간을 위해 양식 아르
파트 6 : 다음 문화, 배 (胚)는 고정, 문화 인큐베이터로 전송됩니다
- (배아는 현장 하이브리드화에 대한 처리 수있다면 또는 depc - PBS) 고정 요리는 얼음처럼 차가운 PBS로 가득합니다.
- 문화 인큐베이터에서 제거하고 즉시 얼음에 위치합니다. 문화 요리는 즉시 얼음처럼 차가운 PBS / depc - PBS로 가득합니다.
- 배아는 vitelline 막에서 분리됩니다. 배아는 파스퇴르 피펫의 뭉툭한 끝을 사용하여 고정 접시로 전송됩니다.
- 배아는 무딘 종단 미세 집게를 사용하여 넘어뜨린 것입니다. 고정 접시를 덮고 PBS가 제거됩니다. 정착액가 추가됩니다 (노트를 참조하십시오 [B]).
- 응용 프로그램에 따라, 배아는 4에서 6-8 시간에 대한 고정 ° C (그라 이오 스탯), 4 O / N ° C (시터스)를, 또는 전체 탑재 immunohistochemistry에 대한 RT에서 1 시간.
- 정착액은 얼음처럼 차가운 PBS / depc PBS로 제거하고 교체합니다.
- 원위치 하이브리드화 또는 immantibody의 얼룩에 같은 다운 스트림 응용 프로그램의 경우 : 신경계와 심장이 뭉툭한 끝 microcapillary 바늘이나 microdissection 나이프를 사용하여 천공되며 이것은 나중 단계에서 프로브 / 항체의 트래핑 방지할 수 있습니다.
참고 : [A] 호수가 구성되어 솔루션 (1 게 ...) : 121.0 g NaCl, 15.5 g KCl, 10.4 g CaCl 2 0.2 H 2 O, 12.7 g MgCl 2 0.6 H 2 O, 용액 B (일리터에 대한) : 2.4 g 나 2 HPO 4 0.2 H 2 O, 0.2 g 아니 2 PO 4 0.2 H 2 O, 압력솥, 사용하기 전에는, 120 ML를 섞어 2700 ML H 2 O로, 180 ML B. 혼합 추가 [1]; [B] 정착액이 (4 % 시터스에 대한 PBS 또는 depc - PBS에 PFA)를 사용 직전 준비가되어 있습니다.
7 부 : 대표 결과
문화 이전의 배아는 원시 리크 단계 (HH4)에 있습니다. 문화 기간의 끝에, 배아는 HH10 (길이 2-3밀리미터)을 개발하고 문화 요리의 중앙에 표시됩니다있다. 형광 DiI를 carbocyanine과 세포의 그룹을 분류하는 것이 가능단지 문화 전 (오)와 문화 시대를 통해 자신의 움직임을 따르십시오. 이 경우, Hensen의 노드 (HN) 아래의 세포는 DiI으로 표시되었습니다. 이러한 세포는 점차적으로 개발 somites (솜)와 notochord (N)에 기여 표시됩니다. 
8 부 : 문제 해결
| 문제 | 원인 | 치료제 |
|---|---|---|
| 난자는 멤브레인 (2 단계)로 내려 와요 대신 노른자로 남아 | 불쌍한 계란 품질 | 접수시 13 스토어 계란 ° C; 요청 신선한 계란을 생산. 계란에게 도착 날짜와 같은 하루를 품어. |
| 멀리 반지 시계 제조인의 유리 아래 배치 (3 단계)에서 Vitelline 막 슬라이드 | 알부민 잔존물 | 2 단계에서는 모든 알부민이 기울어져 집게로 막은에서 돌아서에 의해 제거되어 있는지 확인합니다 |
| 난자는 액세스할 수 있습니다 멤브레인 (4 단계) 아래에 자리잡고 | 막의 잘못된 측면이 이상합니다 | 3 단계에서 노른자의 과립이 들어있는 막의 측면이 위쪽을 향하고 있는지 확인하십시오. 반짝, 광택 쪽을 아래쪽으로 직면한다. |
| 난자는 (단계 6) 호수 / 알부민 다음과 문화에 빠져들 | 이전 문화에 반지 안쪽 왼쪽 알부민 / 살린, 막에 구멍 | 5 단계에서 호수 / 모든 알부민은 반지 안쪽에서 제거되었는지 확인, 4 단계에서 (퉁명스러운 종료 포셉 사용) 포셉와 피어스 막하지 않도록 |
| 배아는 다음과 문화를 분해 | 세균 감염 | 모든 도구 및 유리 제품을 소독하는 것은, 사용 antimycotic / 항생제 |
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Discussion
새로운 문화 방법 2 원위치 하이브리드화 및 전체 마운트 immunohistochemistry 4 전체 마운트 구슬 3, 포함하는 성장 인자의 이식에 이르기까지 애플 리케이션의 광범위한 사용하실 수 있습니다. 24 시간 기간 동안 문화는 시간 저속 세포의 움직임 분석 5 GFP 6 electroporated 구조를 포함하는 모니터링과 같은 어플 리케이션에서 배아 개발의 지속적인 모니터링이 가능합니다.
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Acknowledgments
이 작품은 RHF에 마가렛 M. 알켁 재단에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Marsh Automatic Incubator | Tool | Lyon | RX | |
| Hybridization Incubator | Tool | Robbins Scientific, SciGene | M1000 | |
| Pyrex dish (2) | Tool | |||
| Watchmaker’s glass 50mm | Tool | VWR international | 66112-060 | |
| Glass rings | Tool | Physical Plant facility | cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish. | |
| Curved Forceps (1) | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Surgery | Fine Science Tools | 11002-13 | blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil |
| Sharpening Stone Dan’s Black Arkansas | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 62082-00 | |
| Fine scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon BD | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Microcapillary tube | Surgery | Sigma-Aldrich | P1049-1PAK | Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps |
| Microdissecting knife | Surgery | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization |
| Minuten pins 0.2mm diam | Surgery | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave |
References
- Pannett, P. A., Compton, C. A. The cultivation of tissues in saline. Lancet. 206, 381-384 (1924).
- New, D. T. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. J. Embryol. Exp. Morph. 3, 326-331 (1955).
- Alvarez, I. S., Araujo, M., Nieto, M. A. Neural induction in whole chick embryo cultures by FGF. Dev. Biol. 199, 42-54 (1998).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Fates and migratory routes of primitive streak cells in the chick embryo. Development. 122, 1523-1534 (1996).
- Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protoc. 3, 419-426 (2008).
