Summary
Deze video toont nieuwe cultuur, een methode waarbij kippenembryo's zich buiten het ei gekweekt tot 24 uur. Deze methode stelt je in staat om te studeren vroege ontwikkeling (primitieve streep tot 14 som.), Een periode die overeenkomt met E7-9 in de muis. Toepassingen van deze techniek zijn onder elektroporatie, in situ hybridisatie en immunohistochemie.
Abstract
Het kuiken embryo is een waardevol instrument in de studie van de vroege embryonale ontwikkeling. De transparantie, toegankelijkheid en het gemak van manipulatie, maken het een ideaal hulpmiddel voor het bestuderen van de vorming en patroonvorming van de hersenen, neurale buis, somiet en hart primordia. Toepassingen van kippenembryo cultuur onder electroporatie van DNA of RNA-constructen om genfunctie, enten van de groeifactor gecoate parels zoals FGF-en BMP's, evenals ganse berg te analyseren in situ hybridisatie en immunohistochemie. Deze video toont de verschillende stappen in kippenembryo cultuur, Ten eerste, het embryo geëxplanteerd in een zoutoplossing. Vervolgens wordt het embryo gecentreerd op een glazen ring. De vliezen rondom het embryo worden opgeheven langs de wanden van de ring. De ring wordt dan geplaatst in een cultuur schotel met een pool van albumine. De cultuur gerecht is afgesloten en geplaatst in een vochtige kamer, waar het embryo wordt gekweekt voor maximaal 24 uur. Ten slotte wordt de embryo verwijderd van de ring, vaste en verwerkt voor verdere toepassingen. Een gids is het oplossen van problemen ook gepresenteerd.
Protocol
Deel 1: Bench opgezet
- Een vochtige kamer wordt bereid door het plaatsen van Kimwipe / DDH 2 O in plastic kamer.
- Een Falcon buis aan albumine, gerechten voor cultuur, ringen, horlogeglas en verwerking van afval te verzamelen worden geplaatst op bankje.
- Pyrex schaal is gevuld met 1,4 l zoutoplossing (zie opmerkingen [a]).
Deel 2: Embryo is geëxplanteerde in zoutoplossing
- Eieren worden verwijderd uit de broedmachine na 16 uur (fase 4). Het ei is opene door te tikken op de shell met een tang. Shell stukken zijn verwijderd.
- De dunne albumine wordt verzameld in Falcon buis. De dikke albumine wordt verwijderd met een pincet.
- Het embryo wordt geplaatst in een plastic schaaltje in de zoute schotel. De resterende albumine wordt verwijderd met een pincet.
Deel 3: Embryo is gericht op ring
- De dooierzak is gekanteld met een pincet, zodat embryo naar boven wijst.
- De dooierzak is geknipt op het niveau van de evenaar of lager.
- Met behulp van fijne tang, is de vitelline membraan snel geschild. De vitelline membraan is zo georiënteerd dat de korrelige kant (niet glanzend) naar boven gezichten.
- Met behulp van fijne tang, is de vitelline membraan op het horlogeglas.
- Met behulp van fijne pincet, is een glazen ring aangebracht op de top van vitelline membraan en het embryo in het midden.
- De vitelline membraan wordt opgeheven rond randen van de glazen ring. De montage wordt verwijderd uit de zoutoplossing schotel.
Deel 4: De cultuur is ingesteld onder de microscoop
- De vitelline membraan wordt opgetild boven de glazen ring met fijn pincet onder de microscoop.
- Met behulp van Pasteur pipet, is de zoutoplossing verwijderd van de buitenste rand van de ring.
- Met behulp van fijne schaar, is teveel vitelline membraan verwijderd uit de binnenkant van het glas ring. Er wordt op gelet niet te doorboren het membraan met pipet of tang.
- Het embryo wordt voorzichtig gespoeld met zoutoplossing om losse membranen en eigeel cellen te verwijderen.
- 200 pi zoutoplossing wordt toegevoegd aan buitenkant van de ring (dit zal later te vergemakkelijken).
- De montage is afgedekt met een omgekeerde plastic schaaltje.
Deel 5: De cultuur wordt overgedragen aan incubator
- Een Falcon cultuur schotel is gelabeld.
- 2,5 ml van dunne albumine wordt toegevoegd aan de bodem van de Falcon schotel.
- 200μl van dunne albumine wordt toegevoegd aan de binnenrand van de deksel van de Falcon schotel.
- De omgekeerde schotel wordt verwijderd uit de vergadering.
- Met behulp van fijne tang, is de glazen ring geschoven langs de rand van het horlogeglas, en overgedragen aan de Falcon schotel.
- Alle overige zoutoplossing wordt verwijderd uit inwendig oppervlak van de ring.
- De Falcon schotel is bedekt met deksel en verzegeld.
- De montage is geplaatst in vochtige kamer en daarna in de incubator.
- De embryo's worden gekweekt tot 24 uur bij 38 ° C.
Deel 6: Na de cultuur, is het embryo vast, cultuur wordt overgedragen aan incubator
- Een fixatie schotel is gevuld met ijskoude PBS (of DEPC-PBS als embryo's moeten worden verwerkt voor de in situ hybridisatie).
- De cultuur is verwijderd uit de incubator en direct op ijs geplaatst. De cultuur gerecht wordt onmiddellijk gevuld met ijskoude PBS / DEPC-PBS.
- Het embryo is losgemaakt van de vitelline membraan. Het embryo wordt overgebracht naar de fixatie gerecht, het gebruik van de stompe eind van een Pasteur pipet.
- Het embryo wordt vastgepind met stompe fijne pincet. De PBS voor de fixatie gerecht wordt verwijderd. Fixeermiddel wordt toegevoegd (zie opmerkingen [b]).
- Afhankelijk van de toepassing, wordt het embryo vast voor 6-8 uur bij 4 ° C (cryostaat), O / N bij 4 ° C (in situs), of 1 uur bij RT voor de ganse berg immunohistochemie.
- Het fixatief is verwijderd en vervangen door ijskoud PBS / DEPC PBS.
- Voor downstream toepassingen, zoals in situ hybridisatie of immantibody vlekken: het zenuwstelsel en het hart zijn geperforeerd met behulp van een stomp uiteinde microcapillaire naald of een microdissectie mes, dit zal voorkomen dat het vangen van probe / antilichaam in latere stappen.
Opmerkingen: [a] Saline bestaat uit: oplossing A (voor 1 l): 121,0 g NaCl, 15,5 g KCl, 10,4 g CaCl 2 .2 H 2 O, 12,7 g MgCl 2 0.6 H 2 O, oplossing B (voor 1 l) : 2,4 g Na 2 HPO 4 .2 H 2 O, 0,2 g NaH 2 PO 4 .2 H 2 O, Autoclaaf, voorafgaand aan het gebruik, mix 120 ml A met 2700 ml H 2 O; Voeg 180 ml B. Mix [1]; [b] Fixatief is vlak voor gebruik bereid met behulp (4% PFA in PBS of DEPC-PBS in situs).
Deel 7: representatieve resultaten
Voorafgaand aan de cultuur, het embryo wordt in primitieve streep stadium (HH4). Aan het einde van de cultuur periode is de embryo ontwikkeld om HH10 (lengte 2-3 mm) en is zichtbaar in het centrum van de cultuur schotel. Het is mogelijk om een groep cellen label met carbocyanine fluorescerende DIInet voor cultuur (0h) en volg hun beweging in de cultuur periode. In dit geval werden de cellen onder knooppunt Hensen's (HN) gelabeld met DII. Deze cellen worden getoond bij te dragen aan de geleidelijke ontwikkeling van somieten (SOM) en notochord (n). 
Deel 8: het oplossen van problemen
| Probleem | Veroorzaken | Remedie |
|---|---|---|
| Embryo blijft bij dooier in plaats van komen af met membraan (stap 2) | Slechte kwaliteit van de eieren | Verzoek vers geproduceerde eieren; Store eitjes bij 13 ° C bij ontvangst. Incubeer eieren op dezelfde dag als de dag van aankomst. |
| Vitelline membraan wegglijden van glas horlogemakerij na plaatsing van de ring (stap 3) | Albumine restanten | In stap 2, zorg ervoor dat alle albumine wordt verwijderd door te trekken uit de buurt van membraan met gekanteld tang |
| Embryo is ontoegankelijk: ligt onder het membraan (stap 4) | Verkeerde kant van de membraan wordt naar boven | In stap 3, zorg ervoor dat de kant van het membraan met dooier korrels is naar boven gericht. De glanzend gepolijste kant moet naar beneden wijzen. |
| Embryo ondergedompeld in een zoutoplossing / albumine volgende cultuur (stap 6) | Zout / albumine linker binnenkant van de ring voorafgaand aan de cultuur; gat in membraan | In stap 5, ervoor zorgen dat alle albumine / zoutoplossing wordt verwijderd uit binnen de ring, in stap 4, zorg ervoor dat je niet doorboren membraan met een pincet (gebruik stomp eindigde tang) |
| Embryo uiteengevallen volgende cultuur | Bacteriële infectie | Steriliseren alle gereedschappen en glaswerk, Gebruik antibiotica / antimycotica |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De nieuwe cultuur van methode 2 kan gebruikt worden voor een breed scala aan toepassingen, variërend van enten van de groei factor met kralen 3, op hele berg in situ hybridisatie en hele berg immunohistochemie 4. Cultuur over een periode van 24 uur maakt de continue monitoring van de embryonale ontwikkeling in toepassingen zoals time lapse cel bewegingsanalyse 5 of de monitoring van GFP met geëlektroporeerd constructen 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Margaret M. Alkek Stichting RHF.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Marsh Automatic Incubator | Tool | Lyon | RX | |
| Hybridization Incubator | Tool | Robbins Scientific, SciGene | M1000 | |
| Pyrex dish (2) | Tool | |||
| Watchmaker’s glass 50mm | Tool | VWR international | 66112-060 | |
| Glass rings | Tool | Physical Plant facility | cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish. | |
| Curved Forceps (1) | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Surgery | Fine Science Tools | 11002-13 | blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil |
| Sharpening Stone Dan’s Black Arkansas | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 62082-00 | |
| Fine scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon BD | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Microcapillary tube | Surgery | Sigma-Aldrich | P1049-1PAK | Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps |
| Microdissecting knife | Surgery | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization |
| Minuten pins 0.2mm diam | Surgery | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave |
References
- Pannett, P. A., Compton, C. A. The cultivation of tissues in saline. Lancet. 206, 381-384 (1924).
- New, D. T. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. J. Embryol. Exp. Morph. 3, 326-331 (1955).
- Alvarez, I. S., Araujo, M., Nieto, M. A. Neural induction in whole chick embryo cultures by FGF. Dev. Biol. 199, 42-54 (1998).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Fates and migratory routes of primitive streak cells in the chick embryo. Development. 122, 1523-1534 (1996).
- Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protoc. 3, 419-426 (2008).
