Summary
यह वीडियो नई संस्कृति, एक तरीका है जिसके द्वारा लड़की भ्रूण अंडे के बाहर 24 घंटे के लिए संवर्धित कर रहे हैं दर्शाता है. इस विधि जल्दी (14 सोम के लिए आदिम लकीर) विकास, एक माउस में E7-9 इसी अवधि के अध्ययन करने के लिए सक्षम बनाता है. इस तकनीक का आवेदन electroporation स्वस्थानी संकरण और immunohistochemistry में शामिल हैं.
Abstract
लड़की भ्रूण जल्दी भ्रूण के विकास के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण उपकरण है. इसकी पारदर्शिता, पहुंच, और हेरफेर की आसानी, यह गठन और मस्तिष्क, तंत्रिका ट्यूब somite, और दिल primordia patterning के अध्ययन के लिए एक आदर्श उपकरण बनाते हैं. लड़की भ्रूण संस्कृति के आवेदन डीएनए या शाही सेना के constructs electroporation शामिल क्रम में स्वस्थानी संकरण और immunohistochemistry में जीन समारोह, विकास FGFs और BMPs जैसे कारक लिपटे मोतियों के grafts के रूप में अच्छी तरह से पूरे माउंट का विश्लेषण है. इस वीडियो लड़की भ्रूण संस्कृति में विभिन्न चरणों को दर्शाता है, पहले, भ्रूण खारा में explanted है. फिर, भ्रूण एक गिलास अंगूठी पर केंद्रित है. भ्रूण झिल्ली अंगूठी की दीवारों के साथ उठा रहे हैं. अंगूठी तो albumine का एक पूल युक्त एक संस्कृति डिश में रखा गया है. संस्कृति डिश मोहरबंद और एक नम कक्ष में रखा, जहां भ्रूण 24 बजे तक के लिए सुसंस्कृत है. अंत में, भ्रूण की अंगूठी से निकाल दिया जाता है, फिक्स्ड और अधिक अनुप्रयोगों के लिए संसाधित. समस्या निवारण मार्गनिर्देशिका भी प्रस्तुत किया है.
Protocol
भाग 1: पीठ स्थापित
- एक नम चैम्बर / Kimwipe DDH 2 हे प्लास्टिक कक्ष में रखकर तैयार है.
- एक फाल्कन albumin, संस्कृति, अंगूठियां, watchglass और अपशिष्ट निपटान के लिए व्यंजन इकट्ठा ट्यूब बेंच पर रखा जाता है.
- Pyrex पकवान 1.4 एल खारा के साथ भरा है (नोट्स देखें [एक]).
भाग 2: भ्रूण खारा में explanted है
- अंडे इनक्यूबेटर से 16 बजे (4 चरण) के बाद हटा रहे हैं. अंडा संदंश के साथ खोल दोहन द्वारा opene है. शैल टुकड़े हटा रहे हैं.
- पतली albumin फाल्कन ट्यूब में एकत्र किया जाता है. मोटी albumin संदंश के साथ हटा दिया जाता है.
- भ्रूण खारा पकवान अंदर एक प्लास्टिक पकवान में रखा गया है. शेष albumin संदंश के साथ हटा दिया जाता है.
भाग 3: भ्रूण अंगूठी पर केंद्रित है
- जर्दी थैली संदंश के साथ झुका हुआ है ताकि भ्रूण ऊपर की तरफ चेहरे.
- जर्दी थैली भूमध्य रेखा के स्तर पर या नीचे काट रहा है.
- ठीक संदंश का प्रयोग, vitelline झिल्ली तेजी से खुली है. vitelline झिल्ली तो उन्मुख है कि इसकी बारीक पक्ष (गैर हाकी) ऊपर की तरफ चेहरे.
- ठीक संदंश का प्रयोग, vitelline झिल्ली घड़ी का शीशा पर रखा गया है.
- ठीक संदंश का प्रयोग, एक गिलास अंगूठी vitelline झिल्ली के शीर्ष पर लागू किया जाता है और भ्रूण केंद्रित है.
- vitelline झिल्ली कांच की अंगूठी के किनारों के आसपास उठाया है. विधानसभा नमकीन पकवान से निकाल दिया जाता है.
भाग 4: संस्कृति खुर्दबीन के नीचे सेट कर दिया जाता है
- vitelline झिल्ली गिलास खुर्दबीन के नीचे ठीक संदंश का उपयोग अंगूठी पर उठाया है.
- पाश्चर विंदुक का प्रयोग, खारा अंगूठी के बाहरी छोर से हटा दिया है.
- ठीक कैंची का प्रयोग, अतिरिक्त vitelline झिल्ली कांच की अंगूठी के अंदरूनी किनारे से हटा दिया जाता है. देखभाल नहीं पियर्स विंदुक या संदंश के साथ झिल्ली को ले लिया है.
- भ्रूण धीरे से नमक के साथ rinsed है ढीला झिल्ली और जर्दी कोशिकाओं को हटाने.
- 200 μl खारा अंगूठी (बाद में इस हस्तांतरण सुविधा होगी) के बाहरी किनारे करने के लिए जोड़ा जाता है.
- विधानसभा एक औंधा प्लास्टिक डिश के साथ कवर किया जाता है.
भाग 5: संस्कृति इनक्यूबेटर के लिए स्थानांतरित कर रहा है
- एक फाल्कन संस्कृति डिश लेबल है.
- पतली albumin के 2.5ml फाल्कन पकवान के नीचे करने के लिए जोड़ा जाता है.
- पतली albumin 200μl फाल्कन डिश के ढक्कन के भीतरी किनारे करने के लिए जोड़ा जाता है.
- उल्टे पकवान विधानसभा से निकाल दिया जाता है.
- ठीक संदंश का प्रयोग, कांच की अंगूठी घड़ी का शीशा की बढ़त के साथ slided है, और फाल्कन पकवान को हस्तांतरित.
- सभी शेष खारा अंगूठी की भीतरी सतह से निकाल दिया जाता है.
- फाल्कन पकवान ढक्कन के साथ कवर किया जाता है और सील.
- विधानसभा नम कक्ष में तो और इनक्यूबेटर में रखा गया है.
- भ्रूण के लिए सुसंस्कृत हैं 38 डिग्री सेल्सियस पर 24 बजे तक
भाग 6: के बाद संस्कृति, भ्रूण तय हो गई है, संस्कृति इनक्यूबेटर के लिए स्थानांतरित कर रहा है
- एक नियतन पकवान पीबीएस ठंडा के साथ भरा है (या depc - पीबीएस अगर भ्रूण के लिए स्वस्थानी संकरण में संसाधित किया जा रहे हैं ).
- संस्कृति इन्क्यूबेटर से निकाल दिया जाता है और तुरंत बर्फ पर रखा है. संस्कृति डिश तुरंत ठंडा पीबीएस / depc - पीबीएस से भरा है.
- भ्रूण vitelline झिल्ली से अलग है. भ्रूण निर्धारण पकवान करने के लिए स्थानांतरित कर रहा है, एक पाश्चर विंदुक कुंद अंत का उपयोग.
- भ्रूण नीचे टिकी है कुंद समाप्त ठीक संदंश का उपयोग. नियतन पकवान कवर पीबीएस हटा दिया है. लगानेवाला जोडी (नोट्स देखें [ख]).
- आवेदन के आधार पर, भ्रूण 6-8 घंटा के लिए 4 में तय है ° सी (cryostat), हे / 4 बजे एन डिग्री सेल्सियस (situs में), या पूरे माउंट immunohistochemistry के लिए 1 घंटा आरटी पर.
- लगानेवाला निकाल दिया है और ठंडा पीबीएस / depc पीबीएस के साथ प्रतिस्थापित.
- जैसे बहाव के अनुप्रयोगों के लिए में स्वस्थानी संकरण या immantibody धुंधला: तंत्रिका तंत्र और हृदय एक कुंद अंत microcapillary सुई या एक microdissection चाकू का उपयोग छेदा कर रहे हैं, यह बाद के चरणों में जांच / एंटीबॉडी के फँसाने को रोकने जाएगा.
नोट: [एक] खारा के होते हैं: समाधान (एल 1 के लिए): 121.0 छ NaCl, 15.5 छ KCl, 10.4 छ 2 CaCl .2 एच 2 हे, 12.7 छ 2 MgCl 0.6 एच 2 हे, समाधान बी (1 एल के लिए ) : 2.4 छ ना 2 4 0.2 एच 2 हे, 0.2 ग्राम नाह 2 पीओ 4 0.2 एच 2 हे HPO, आटोक्लेव, उपयोग करने के लिए पिछले, 120 मिलीलीटर का मिश्रण के साथ 2700 मिलीलीटर एच 2 हे, 180 मिलीलीटर बी मिक्स जोड़ें [1 ]; [ख] लगानेवाला से ठीक पहले का उपयोग करने के लिए तैयार है (4% situs में पीबीएस या depc - पीबीएस में पीएफए).
भाग 7: प्रतिनिधि परिणाम
संस्कृति से पहले भ्रूण आदिम लकीर मंच (HH4) पर है. संस्कृति की अवधि के अंत में, भ्रूण HH10 लंबाई (2-3 मिमी) विकसित की है और पकवान संस्कृति के केंद्र में दिखाई देता है. यह संभव है फ्लोरोसेंट DiI carbocyanine के साथ कोशिकाओं का एक समूह लेबलसंस्कृति बस से पहले (0h) और संस्कृति की अवधि भर में उनके आंदोलन का पालन करें. इस मामले में, Hensen नोड (हेमवती) के नीचे कोशिकाओं DiI के साथ लेबल रहे थे. इन कोशिकाओं को उत्तरोत्तर विकासशील (सोम) somites और notochord (एन) के लिए योगदान करने के लिए दिखाए जाते हैं. 
8 पार्ट: समस्या निवारण
| समस्या | कारण | उपाय |
|---|---|---|
| भ्रूण की जर्दी के साथ झिल्ली (चरण 2) के साथ बाहर आने के बजाय रहता है | गरीब अंडे की गुणवत्ता | प्राप्त होने पर में 13 स्टोर अंडे ° सी, अनुरोध हौसले से अंडे का उत्पादन. अंडे आगमन की तारीख के रूप में एक ही दिन सेते हैं. |
| Vitelline झिल्ली अंगूठी के घड़ीसाज़ कांच निम्नलिखित प्लेसमेंट (कदम 3) से दूर स्लाइड | Albumin अवशेष | चरण 2 में, सुनिश्चित करें कि सभी albumin इसे खींच दूर झुका संदंश के साथ झिल्ली से निकाल दिया जाता है |
| भ्रूण दुर्गम है: झिल्ली (चरण 4) के नीचे स्थित है | झिल्ली के गलत ओर ऊपर की तरफ है | चरण 3 में, सुनिश्चित करें कि जर्दी granules युक्त झिल्ली की ओर ऊपर का सामना करना पड़ रहा है. चमकदार, पॉलिश की ओर नीचे की ओर का सामना करना चाहिए. |
| भ्रूण खारा / albumin निम्नलिखित संस्कृति में डूबे हुए (चरण 6) | / खारा संस्कृति से पहले की अंगूठी के अंदर बाईं albumin, झिल्ली में छेद | चरण 5 में, सुनिश्चित करें कि सभी / albumin खारा अंगूठी के अंदर से निकाल दिया जाता है, चरण 4 में, सुनिश्चित करें कि आप संदंश के साथ बेध झिल्ली नहीं (कुंद समाप्त संदंश का उपयोग) |
| भ्रूण विघटित निम्नलिखित संस्कृति | जीवाणु संक्रमण | जीवाणुरहित सभी उपकरण और कांच के बने पदार्थ, का उपयोग करें / एंटीबायोटिक antimycotic |
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Discussion
नई संस्कृति विधि 2 आवेदनों की एक विस्तृत विविधता, वृद्धि स्वस्थानी संकरण और पूरे माउंट 4 immunohistochemistry में 3 पूरे माउंट करने के लिए मोती, युक्त कारक के grafts से लेकर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक 24 घंटा अवधि में संस्कृति समय व्यतीत हो सेल आंदोलन 5 विश्लेषण या GFP electroporated constructs 6 युक्त की निगरानी जैसे अनुप्रयोगों में भ्रूण के विकास की सतत निगरानी के लिए सक्षम बनाता है.
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Acknowledgments
यह काम मार्गरेट एम. Alkek RHF फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Marsh Automatic Incubator | Tool | Lyon | RX | |
| Hybridization Incubator | Tool | Robbins Scientific, SciGene | M1000 | |
| Pyrex dish (2) | Tool | |||
| Watchmaker’s glass 50mm | Tool | VWR international | 66112-060 | |
| Glass rings | Tool | Physical Plant facility | cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish. | |
| Curved Forceps (1) | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Surgery | Fine Science Tools | 11002-13 | blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil |
| Sharpening Stone Dan’s Black Arkansas | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 62082-00 | |
| Fine scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon BD | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Microcapillary tube | Surgery | Sigma-Aldrich | P1049-1PAK | Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps |
| Microdissecting knife | Surgery | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization |
| Minuten pins 0.2mm diam | Surgery | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave |
References
- Pannett, P. A., Compton, C. A. The cultivation of tissues in saline. Lancet. 206, 381-384 (1924).
- New, D. T. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. J. Embryol. Exp. Morph. 3, 326-331 (1955).
- Alvarez, I. S., Araujo, M., Nieto, M. A. Neural induction in whole chick embryo cultures by FGF. Dev. Biol. 199, 42-54 (1998).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Fates and migratory routes of primitive streak cells in the chick embryo. Development. 122, 1523-1534 (1996).
- Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protoc. 3, 419-426 (2008).
