Summary
Questo video dimostra nuova cultura, un metodo con cui sono coltivati embrioni di pollo al di fuori l'uovo per un massimo di 24 ore. Questo metodo permette di studiare lo sviluppo precoce (stria primitiva a 14 som.), Un periodo corrispondente a E7-9 nel topo. Le applicazioni di questa tecnica sono elettroporazione, ibridazione in situ e immunoistochimica.
Abstract
L'embrione di pollo è uno strumento prezioso per lo studio dello sviluppo embrionale precoce. La sua trasparenza, accessibilità e facilità di manipolazione, lo rendono uno strumento ideale per studiare la formazione ed il modello del cervello, del tubo neurale, somite e primordi cuore. Le domande di cultura pulcino embrione comprendono elettroporazione di costrutti di DNA o RNA per analizzare la funzione del gene, innesti di perle fattore di crescita rivestito come FGF e BMP, così come montare tutto ibridazione in situ e immunoistochimica. Questo video mostra le varie fasi della cultura pulcino embrione; In primo luogo, l'embrione viene espiantato in soluzione salina. Poi, l'embrione è centrato su un anello di vetro. Le membrane che circondano l'embrione si sollevano lungo le pareti dell'anello. L'anello viene posto in un piatto di coltura contenente un pool di albumina. Il piatto cultura è sigillato e posto in una camera umida, in cui l'embrione è colta per un massimo di 24 ore. Infine, l'embrione viene rimosso dal ring, fissa e trattati per ulteriori applicazioni. Una guida alla risoluzione è anche presentato.
Protocol
Parte 1: banco costituito
- Una camera umida viene preparato mettendo Kimwipe / DDH 2 O in camera di plastica.
- Un tubo Falcon per raccogliere l'albumina, stoviglie per la cultura, anelli, vetro d'orologio e lo smaltimento dei rifiuti sono posti in panchina.
- Pirofila è riempito di soluzione salina 1,4 l (vedere le note [a]).
Parte 2: Embrione è espiantati in soluzione fisiologica
- Le uova sono ritirate dall 'incubatrice dopo 16 ore (fase 4). L'uovo è opene toccando il guscio con una pinza. Pezzi di conchiglia vengono rimossi.
- L'albumina sottile è raccolto in tubi Falcon. L'albumina spesso viene rimosso con una pinza.
- L'embrione si trova in un piatto di plastica dentro il piatto salina. L'albumina rimanente viene rimosso con una pinza.
Parte 3: Embrione è centrato sull'anello
- Il sacco vitellino è inclinato con una pinza in modo da embrione rivolto verso l'alto.
- Il sacco vitellino viene tagliato a livello dell'equatore o al di sotto.
- Utilizzando una pinza sottile, la membrana vitellina è rapidamente pelati. La membrana vitellina è orientato in modo che il suo lato granulare (shinny non) verso l'alto.
- Utilizzando una pinza sottile, la membrana vitellina è posizionato sul vetro dell'orologio.
- Utilizzando una pinza sottile, un anello di vetro viene applicato sulla parte superiore della membrana vitellina e l'embrione è centrato.
- La membrana vitellina è alzata intorno ai bordi del ring vetro. L'assemblea viene rimosso dal piatto salina.
Parte 4: La cultura è istituito ai sensi microscopio
- La membrana vitellina è alzata sopra l'anello di vetro con una pinza sottile al microscopio.
- Utilizzando una pipetta Pasteur, la soluzione salina viene rimosso dal bordo esterno dell'anello.
- Utilizzando forbici, l'eccesso membrana vitellina viene rimosso dal bordo interno dell'anello di vetro. Si fa attenzione a non forare la membrana con la pipetta o pinze.
- L'embrione viene delicatamente risciacquato con soluzione fisiologica per rimuovere le membrane sciolti e cellule uovo.
- 200 microlitri soluzione salina viene aggiunto al bordo esterno dell'anello (questo faciliterà in seguito di trasferimento).
- L'assemblea è coperto da un piatto di plastica rovesciata.
Parte 5: La cultura è trasferito al incubatore
- Un piatto della cultura Falcon è etichettato.
- 2,5 ml di albumina sottile si aggiunge al fondo del piatto Falcon.
- 200μl di albumina sottile viene aggiunta al bordo interno del coperchio del piatto Falcon.
- Il piatto invertito viene rimosso dal gruppo.
- Utilizzando una pinza sottile, l'anello di vetro è scivolò lungo il bordo del vetro d'orologio, e trasferito al piatto Falcon.
- Tutte le saline rimanente viene rimosso dalla superficie interna dell'anello.
- Il piatto Falcon è coperto con il coperchio e sigillato.
- L'assemblea è posto in camera umida e poi in incubatrice.
- Gli embrioni sono coltivate fino a 24 ore a 38 ° C.
Parte 6: Dopo la cultura, l'embrione è fisso, la cultura viene trasferito incubatore
- Un piatto fissazione è pieno di ghiaccio PBS freddo (o DEPC-PBS, se gli embrioni debbano essere trattati per ibridazione in situ).
- La cultura viene rimosso dal termostato e subito immesso sul ghiaccio. Il piatto cultura è immediatamente riempito di ghiaccio freddo PBS / DEPC-PBS.
- L'embrione si stacca dalla membrana vitellina. L'embrione viene trasferito il piatto fissazione, usando la punta di una pipetta Pasteur.
- L'embrione viene immobilizzato con una pinza sottile blunt-ended. La PBS che copre il piatto fissazione viene rimosso. Fissativo è aggiunto (vedi note [b]).
- A seconda dell'applicazione, l'embrione è fissato per 6-8 ore a 4 ° C (criostato), O / N a 4 ° C (in situs), o 1 ora a temperatura ambiente per tutta immunoistochimica montaggio.
- Il fissativo viene rimosso e sostituito con ghiacciata PBS / PBS DEPC.
- Per applicazioni a valle, come l'ibridazione in situ o colorazione immantibody: il sistema nervoso e il cuore sono forate con un ago smussato fine microcapillare o un coltello microdissezione, questo impedirà cattura della sonda / anticorpi nei passaggi successivi.
Note: [a] Saline composta da: soluzione A (per 1 l): 121,0 g NaCl, 15,5 g di KCl, 10,4 g di CaCl 2 .2 H 2 O, 12,7 g di MgCl 2 .6 H 2 O, soluzione B (per 1 l) : 2,4 g Na 2 HPO 4 .2 H 2 O, 0,2 g di NaH 2 PO 4 .2 H 2 O; autoclave; Prima dell'uso, miscelare 120 ml A con 2700 ml di H 2 O; Aggiungere 180 ml B. Mix [1]; [b] Fixative è preparata al momento dell'uso (4% PFA in PBS o DEPC-PBS nel situs).
Parte 7: Risultati Rappresentante
Prima di cultura, l'embrione è allo stadio stria primitiva (HH4). Al termine del periodo di coltura, l'embrione ha sviluppato per HH10 (lunghezza 2-3 mm) ed è visibile al centro del piatto cultura. E 'possibile etichettare un gruppo di cellule con carbocyanine fluorescenti DIIpoco prima di cultura (0h) e seguire il loro movimento per tutto il periodo della cultura. In questo caso, le cellule al di sotto del nodo di Hensen (HN) sono stati etichettati con DII. Queste cellule sono dimostrato di contribuire alla somiti progressivo sviluppo (SOM) e notocorda (n). 
Parte 8: Risoluzione dei problemi
| Problema | Causa | Rimedio |
|---|---|---|
| Embrione rimane con tuorlo invece di venire fuori con membrana (fase 2) | Povero uovo di qualità | Richiesta appena producono uova, uova Conservare a 13 ° C al momento del ricevimento. Incubare le uova il giorno stesso della data di arrivo. |
| Membrana vitellina scivolare lontano dal posizionamento seguenti orologeria bicchiere di anello (fase 3) | Resti di albumina | Al punto 2, assicurarsi che tutti i albumina viene rimosso estraendolo da membrana con una pinza inclinata |
| Embrione è inaccessibile: si trova sotto la membrana (fase 4) | Lato sbagliato della membrana è in alto | Al punto 3, assicurarsi che il lato della membrana contenente granuli di tuorlo è rivolto verso l'alto. Il lucido, lato lucido deve essere rivolto verso il basso. |
| Embrione immerso in soluzione salina / albumina cultura seguente (punto 6) | Foro nella membrana; Saline / albumina sinistra all'interno dell'anello prima di cultura | Nel passaggio 5, verificare che tutti i albumina / soluzione salina viene rimosso dall'interno del ring; Al punto 4, fare attenzione a non forare della membrana con una pinza (uso forcipe smussato conclusa) |
| Embrione disintegrato cultura seguenti | Infezione batterica | Sterilizzare tutti gli strumenti e lavori di vetro, l'uso di antibiotici / antimicotici |
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Discussion
Il metodo di cultura di New 2 può essere utilizzato per una vasta gamma di applicazioni, che vanno da innesti di fattore di crescita contenente microsfere di 3, per montare tutto ibridazione in situ e immunoistochimica intero monte 4. Cultura in un periodo di 24 ore consente il monitoraggio continuo dello sviluppo embrionale in applicazioni quali l'analisi lasso di tempo il movimento delle cellule 5 o il monitoraggio di GFP contenenti costrutti elettroporate 6.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal M. Margaret Alkek Fondazione RHF.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Marsh Automatic Incubator | Tool | Lyon | RX | |
| Hybridization Incubator | Tool | Robbins Scientific, SciGene | M1000 | |
| Pyrex dish (2) | Tool | |||
| Watchmaker’s glass 50mm | Tool | VWR international | 66112-060 | |
| Glass rings | Tool | Physical Plant facility | cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish. | |
| Curved Forceps (1) | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Surgery | Fine Science Tools | 11002-13 | blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil |
| Sharpening Stone Dan’s Black Arkansas | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 62082-00 | |
| Fine scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon BD | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Microcapillary tube | Surgery | Sigma-Aldrich | P1049-1PAK | Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps |
| Microdissecting knife | Surgery | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization |
| Minuten pins 0.2mm diam | Surgery | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave |
References
- Pannett, P. A., Compton, C. A. The cultivation of tissues in saline. Lancet. 206, 381-384 (1924).
- New, D. T. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. J. Embryol. Exp. Morph. 3, 326-331 (1955).
- Alvarez, I. S., Araujo, M., Nieto, M. A. Neural induction in whole chick embryo cultures by FGF. Dev. Biol. 199, 42-54 (1998).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Fates and migratory routes of primitive streak cells in the chick embryo. Development. 122, 1523-1534 (1996).
- Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protoc. 3, 419-426 (2008).
