Denna video visar ny kultur, en metod som kycklingembryon odlas utanför ägget i upp till 24 tim. Denna metod gör en att studera tidig utveckling (primitivstrimman till 14 SOM.) En period som motsvarar E7-9 i mus. Tillämpningar av denna teknik inkluderar elektroporation, in situ hybridisering och immunhistokemi.
Abstract
Den kycklingembryo är ett värdefullt verktyg i studiet av tidiga embryonala utvecklingen. Dess öppenhet, tillgänglighet och enkel manipulation, gör det ett idealiskt verktyg för att studera bildning och mönstring av hjärnan, neuralrörsdefekter, somit och hjärta primordia. Tillämpningar av kycklingembryo kultur inkluderar elektroporering av DNA eller RNA konstruktioner för att analysera geners funktion, ympar av bestruket tillväxtfaktor pärlor som FGFs och BMP, liksom hela montera in situ hybridisering och immunhistokemi. Denna video visar de olika stegen i kycklingembryo kultur, det första är embryot explanterade i koksaltlösning. Då är embryot centrerad på ett glas ring. Membranen omger embryot lyfts längs väggarna i ringen. Ringen placeras sedan i en kultur maträtt som innehåller en pool av albumine. Kulturen skålen är förseglas och placeras i en fuktig kammare, där embryot odlas i upp till 24 timmar. Slutligen är embryot ut ur ringen, fasta och bearbetas för ytterligare ansökningar. En felsökningsguide presenteras också.
Protocol
Del 1: Bänk upprätta En fuktig kammare är beredd genom att placera Kimwipe / DDH 2 O i kammare av plast. En Falcon rör för att samla in albumin, rätter för kultur, ringar, klockglas och avfallshantering placeras på bänken. Pyrex skålen är fylld med 1,4 liter saltlösning (se not [a]). Del 2: Embryo är uttagna i saltlösning Ägg är ur inkubatorn efter 16 timmar (steg 4). Ägget är opene genom att knacka på skalet med pin…
Discussion
Den nya kulturen metod 2 kan användas för en mängd olika tillämpningar, från transplantat av tillväxtfaktor som innehåller pärlor 3, till hela montera in situ hybridisering och hela montera immunohistokemi 4. Kultur över en 24-timmars period möjliggör kontinuerlig övervakning av embryonal utveckling i applikationer såsom tid förfaller celler rörelseanalys 5 eller övervakning av GFP innehåller electroporated konstruktioner 6.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Margaret M. Alkek Foundation för att RHF.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Eggs
Animal
Charles River Laboratories
Premium Fertile
Stereomicroscope
Microscope
Leica Microsystems
MZ9.5 or similar
Marsh Automatic Incubator
Tool
Lyon
RX
Hybridization Incubator
Tool
Robbins Scientific
M1000
Pyrex dish (2)
Tool
Watchmaker’s glass 50mm
Tool
VWR
66112-060
Glass rings
Tool
Physical Plant facility
cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish.
Curved Forceps (1)
Surgery
Electron Microscopy Sciences
72991-4C
Forceps (2)
Surgery
Fine Science Tools
11002-13
blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil
Sharpening Stone Dan’s Black Arkansas
Surgery
Electron Microscopy Sciences
62082-00
Fine scissors
Surgery
Fine Science Tools
14161-10
Plastic dishes
Tool
Falcon
353001
Rubber Bulb
Tool
Electron Microscopy Sciences
70980
Pasteur Capillary Pipette
Tool
Electron Microscopy Sciences
70950-12
round edge under flame
Microcapillary tube
Surgery
Sigma
P1049-1PAK
Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps
Microdissecting knife
Surgery
Fine Science Tools
10056-12
Use to puncture cavities prior to in situ hybridization
Minuten pins 0.2mm diam
Surgery
Fine Science Tools
26002-20
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base
Reagent
Dow Corning
0001986475
Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C