文化早期鸡胚体外（新文化）的方法

Summary

本视频演示了新的文化，鸡胚培养24小时以外的鸡蛋的方法。这种方法使研究的早期发展（原始连胜，以14索姆），鼠标E7 - 9对应一个时期。这项技术的应用，包括电，原位杂交和免疫组化。

Abstract

鸡胚是一个有价值的工具，在早期胚胎发育的研究。其透明度，可获得性和易于操纵，它为研究大脑，神经管，体节和心脏原基的形成和图案的理想工具。鸡胚培养的应用包括电的DNA或RNA的结构，以原位杂交和免疫组织化学分析基因的功能，生长因子，如涂珠FGFs和BMPs的移植，以及整装。本视频演示了在鸡胚培养的不同步骤，首先，胚胎是在生理盐水explanted。然后，胚胎中心的玻璃环上。周围的胚胎膜沿环的墙壁被取消。环，然后放置在文化菜含有白蛋白池。是密封的培养皿中，并放置在潮湿的腔，胚胎培养24小时。最后，胚胎是从环中删除，固定，并为进一步的应用处理。还介绍了故障排除指南。

Protocol

第1部分：台成立

1. 一股潮湿室是放置在塑料商会Kimwipe / DDH _{2 O的}准备。
2. 一个猎鹰管收集白蛋白，文化，戒指，表面玻璃和废物处置的菜都放在替补席上。
3. 耐热盘充满生理盐水1.4升（见注释[A]）。

第2部分：胚胎在盐水explanted

1. 鸡蛋是从孵化器中删除后16小时（第4阶段）。鸡蛋是由攻壳钳opene。壳牌件被删除。
2. 薄白蛋白收集猎鹰管。厚厚的白蛋白是用镊子除去。
3. 胚胎被放置在一个塑料盘内的盐水菜。剩下的白蛋白是用镊子除去。

第3部分：环中心的胚胎

1. 卵黄囊是用镊子倾斜，使胚胎朝上。
2. 卵黄囊是在赤道或以下程度的削减。
3. 卵黄膜是用细镊子，迅速去皮。卵黄膜为导向，因此，其颗粒的一面（非光亮）朝上。
4. 用细镊子，卵黄膜置于手表玻璃上。
5. 用细镊子，玻璃环适用于卵黄膜的顶部，并为中心的胚胎。
6. 卵黄膜是解除了周围的玻璃环的边缘。大会是从盐水菜。

第4部分：文化是设置在显微镜下

1. 卵黄膜是使用显微镜下细的镊子在玻璃环解除。
2. 使用巴斯德吸管，生理盐水从环的外缘。
3. 用细剪刀，多余的卵黄膜是从玻璃环的内侧边缘。护理是采取不刺破膜用吸管或镊子。
4. 胚胎是轻轻地用生理盐水冲洗，去除松散的膜和卵黄细胞。
5. 200μL生理盐水添加到外缘环（这将有利于以后转让）。
6. 大会是覆盖着一个倒置的塑料盘。

第5部分：文化是转移到孵化器

1. 一个标记为“猎鹰培养皿。
2. 薄血白蛋白2.5毫升添加到猎鹰培养皿的底部。
3. 200μL薄血白蛋白被添加到猎鹰培养皿的盖子内缘。
4. 倒菜是从大会。
5. 用细镊子，玻璃环下滑沿表玻璃的边缘，并转移到猎鹰菜。
6. 所有剩余的生理盐水是从环的内表面。
7. 猎鹰盘盖与盖和密封。
8. 大会是放置在潮湿的腔，然后在孵化器。
9. 胚胎培养24小时，在38 ° C

第6部分：文化之后，胚胎是固定的，文化是转移到孵化器

1. 如果胚胎是要处理的原位杂交），一个固定的菜充满了冰冷的PBS（或DEPC - PBS。
2. 文化是从孵化器中删除，并立即置于冰上。立即充满了冰冷的PBS / DEPC - PBS的培养皿。
3. 胚胎从卵黄膜分离。胚胎转移到固定的菜，用巴斯德吸管的钝端。
4. 胚胎是使用罚款钳钝端牵制。 PBS覆盖固定盘被删除。固色剂添加（见注[B]）。
5. 根据应用，胚胎是固定的6-8小时，在4 °℃（恒温器），O / N在4 ° C（所在地），或在室温下1小时整装免疫组织化学
6. 固定液用冰冷的PBS / DEPC PBS拆除和更换。
7. 对于下游应用原位杂交或immantibody染色，如：神经系统和心脏穿孔使用钝年底microcapillary针或显微切割刀，这将防止探头/抗体被困在后面的步骤。
   
   注释 ：[A]盐水解决方案包括：（1升）：121.0 g氯化钠，氯化钾15.5克，10.4克氯化钙₂ .2 H _{2 O，12.7}克氯化镁₂ .6 H _{2 O;} B液（1升） ：2.4克钠₂ HPO ₄ .2 H _{2 O，0.2}克的NaH ₂ PO ₄ .2 H _{2 O;}高压灭菌器，在使用之前，混合120毫升与2700毫升H _{2 O，}加入180毫升乙混合[1]; [B]定影液是在使用前准备（4％PFA在所在地的PBS或DEPC - PBS）。

第7部分：代表结果

文化之前，胚胎是在原始连胜阶段（HH4）。在文化时期的结束，胚胎发展到HH10（长2-3毫米），在培养皿的中心可见。标签carbocyanine荧光DII一组单元格，它是可能的前文化（0H），并按照他们的运动，在整个文化时期。在这种情况下，恒胜的节点（HN）以下细胞标记与DII。这些细胞被证明有助于逐步发展的体节（SOM）和脊索（N）。

第8部分：故障排除

问题	原因	补救
胚胎仍然与蛋黄，而不是膜（步骤2）	卵子质量不佳	要求新鲜鸡蛋;在收到商店鸡蛋在13 ° C。孵育鸡蛋为入住日期的当天。
卵黄膜滑离钟表匠的玻璃环以下的位置（步骤3）	白蛋白残余	在第2步，确保所有白蛋白是从膜拉离倾斜钳移除
胚胎是人迹罕至：位于下方的膜（步骤4）	膜错误的一边向上	在第3步，确保含有蛋黄颗粒膜的一侧朝上。的光泽，抛光的一面应朝下。
淹没在盐水/白蛋白以下文化的胚胎（步骤6）	盐水/白蛋白文化前内环左;在膜孔	在第5步，确保所有白蛋白/生理盐水是从戒指内删除;在第4步，确保你不膜（使用钝结束钳钳皮尔斯）
胚胎解体以下文化	细菌感染	消毒所有的工具和玻璃器皿;使用抗生素/ antimycotic

Discussion

一个广泛的应用，从增长因素含^珠 3，整个装载在原位杂交和整装免疫组织^化学 4移植，可用于新的^培养方法2。超过24小时期间的文化，使胚胎发育的连续监测中的应用，如时间的^推移细胞运动分析5或绿色荧光蛋白^含有电穿孔结构6监测。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Eggs	Animal	Charles River Laboratories	Premium Fertile
Stereomicroscope	Microscope	Leica Microsystems	MZ9.5 or similar
Marsh Automatic Incubator	Tool	Lyon	RX
Hybridization Incubator	Tool	Robbins Scientific, SciGene	M1000
Pyrex dish (2)	Tool
Watchmaker’s glass 50mm	Tool	VWR international	66112-060
Glass rings	Tool	Physical Plant facility		cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish.
Curved Forceps (1)	Surgery	Electron Microscopy Sciences	72991-4C
Forceps (2)	Surgery	Fine Science Tools	11002-13	blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil
Sharpening Stone Dan’s Black Arkansas	Surgery	Electron Microscopy Sciences	62082-00
Fine scissors	Surgery	Fine Science Tools	14161-10
Plastic dishes	Tool	Falcon BD	353001
Rubber Bulb	Tool	Electron Microscopy Sciences	70980
Pasteur Capillary Pipette	Tool	Electron Microscopy Sciences	70950-12	round edge under flame
Microcapillary tube	Surgery	Sigma-Aldrich	P1049-1PAK	Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps
Microdissecting knife	Surgery	Fine Science Tools	10056-12	Use to puncture cavities prior to in situ hybridization
Minuten pins 0.2mm diam	Surgery	Fine Science Tools	26002-20
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base	Reagent	Dow Corning	0001986475	Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
Diethylpyrocarbonate (depc)	Reagent	Acros Organics	10025025	Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave