Questo video dimostra nuova cultura, un metodo con cui sono coltivati embrioni di pollo al di fuori l'uovo per un massimo di 24 ore. Questo metodo permette di studiare lo sviluppo precoce (stria primitiva a 14 som.), Un periodo corrispondente a E7-9 nel topo. Le applicazioni di questa tecnica sono elettroporazione, ibridazione in situ e immunoistochimica.
Abstract
L'embrione di pollo è uno strumento prezioso per lo studio dello sviluppo embrionale precoce. La sua trasparenza, accessibilità e facilità di manipolazione, lo rendono uno strumento ideale per studiare la formazione ed il modello del cervello, del tubo neurale, somite e primordi cuore. Le domande di cultura pulcino embrione comprendono elettroporazione di costrutti di DNA o RNA per analizzare la funzione del gene, innesti di perle fattore di crescita rivestito come FGF e BMP, così come montare tutto ibridazione in situ e immunoistochimica. Questo video mostra le varie fasi della cultura pulcino embrione; In primo luogo, l'embrione viene espiantato in soluzione salina. Poi, l'embrione è centrato su un anello di vetro. Le membrane che circondano l'embrione si sollevano lungo le pareti dell'anello. L'anello viene posto in un piatto di coltura contenente un pool di albumina. Il piatto cultura è sigillato e posto in una camera umida, in cui l'embrione è colta per un massimo di 24 ore. Infine, l'embrione viene rimosso dal ring, fissa e trattati per ulteriori applicazioni. Una guida alla risoluzione è anche presentato.
Protocol
Parte 1: banco costituito Una camera umida viene preparato mettendo Kimwipe / DDH 2 O in camera di plastica. Un tubo Falcon per raccogliere l'albumina, stoviglie per la cultura, anelli, vetro d'orologio e lo smaltimento dei rifiuti sono posti in panchina. Pirofila è riempito di soluzione salina 1,4 l (vedere le note [a]). Parte 2: Embrione è espiantati in soluzione fisiologica Le uova sono ritirate dall 'incubatrice dopo …
Discussion
Il metodo di cultura di New 2 può essere utilizzato per una vasta gamma di applicazioni, che vanno da innesti di fattore di crescita contenente microsfere di 3, per montare tutto ibridazione in situ e immunoistochimica intero monte 4. Cultura in un periodo di 24 ore consente il monitoraggio continuo dello sviluppo embrionale in applicazioni quali l'analisi lasso di tempo il movimento delle cellule 5 o il monitoraggio di GFP contenenti costrutti elettroporate 6.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal M. Margaret Alkek Fondazione RHF.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Eggs
Animal
Charles River Laboratories
Premium Fertile
Stereomicroscope
Microscope
Leica Microsystems
MZ9.5 or similar
Marsh Automatic Incubator
Tool
Lyon
RX
Hybridization Incubator
Tool
Robbins Scientific
M1000
Pyrex dish (2)
Tool
Watchmaker’s glass 50mm
Tool
VWR
66112-060
Glass rings
Tool
Physical Plant facility
cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish.
Curved Forceps (1)
Surgery
Electron Microscopy Sciences
72991-4C
Forceps (2)
Surgery
Fine Science Tools
11002-13
blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil
Sharpening Stone Dan’s Black Arkansas
Surgery
Electron Microscopy Sciences
62082-00
Fine scissors
Surgery
Fine Science Tools
14161-10
Plastic dishes
Tool
Falcon
353001
Rubber Bulb
Tool
Electron Microscopy Sciences
70980
Pasteur Capillary Pipette
Tool
Electron Microscopy Sciences
70950-12
round edge under flame
Microcapillary tube
Surgery
Sigma
P1049-1PAK
Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps
Microdissecting knife
Surgery
Fine Science Tools
10056-12
Use to puncture cavities prior to in situ hybridization
Minuten pins 0.2mm diam
Surgery
Fine Science Tools
26002-20
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base
Reagent
Dow Corning
0001986475
Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C