Deze video toont nieuwe cultuur, een methode waarbij kippenembryo's zich buiten het ei gekweekt tot 24 uur. Deze methode stelt je in staat om te studeren vroege ontwikkeling (primitieve streep tot 14 som.), Een periode die overeenkomt met E7-9 in de muis. Toepassingen van deze techniek zijn onder elektroporatie, in situ hybridisatie en immunohistochemie.
Abstract
Het kuiken embryo is een waardevol instrument in de studie van de vroege embryonale ontwikkeling. De transparantie, toegankelijkheid en het gemak van manipulatie, maken het een ideaal hulpmiddel voor het bestuderen van de vorming en patroonvorming van de hersenen, neurale buis, somiet en hart primordia. Toepassingen van kippenembryo cultuur onder electroporatie van DNA of RNA-constructen om genfunctie, enten van de groeifactor gecoate parels zoals FGF-en BMP's, evenals ganse berg te analyseren in situ hybridisatie en immunohistochemie. Deze video toont de verschillende stappen in kippenembryo cultuur, Ten eerste, het embryo geëxplanteerd in een zoutoplossing. Vervolgens wordt het embryo gecentreerd op een glazen ring. De vliezen rondom het embryo worden opgeheven langs de wanden van de ring. De ring wordt dan geplaatst in een cultuur schotel met een pool van albumine. De cultuur gerecht is afgesloten en geplaatst in een vochtige kamer, waar het embryo wordt gekweekt voor maximaal 24 uur. Ten slotte wordt de embryo verwijderd van de ring, vaste en verwerkt voor verdere toepassingen. Een gids is het oplossen van problemen ook gepresenteerd.
Protocol
Deel 1: Bench opgezet Een vochtige kamer wordt bereid door het plaatsen van Kimwipe / DDH 2 O in plastic kamer. Een Falcon buis aan albumine, gerechten voor cultuur, ringen, horlogeglas en verwerking van afval te verzamelen worden geplaatst op bankje. Pyrex schaal is gevuld met 1,4 l zoutoplossing (zie opmerkingen [a]). Deel 2: Embryo is geëxplanteerde in zoutoplossing Eieren worden verwijderd uit de broedmachine na 16 uur (fase 4). H…
Discussion
De nieuwe cultuur van methode 2 kan gebruikt worden voor een breed scala aan toepassingen, variërend van enten van de groei factor met kralen 3, op hele berg in situ hybridisatie en hele berg immunohistochemie 4. Cultuur over een periode van 24 uur maakt de continue monitoring van de embryonale ontwikkeling in toepassingen zoals time lapse cel bewegingsanalyse 5 of de monitoring van GFP met geëlektroporeerd constructen 6.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Margaret M. Alkek Stichting RHF.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Eggs
Animal
Charles River Laboratories
Premium Fertile
Stereomicroscope
Microscope
Leica Microsystems
MZ9.5 or similar
Marsh Automatic Incubator
Tool
Lyon
RX
Hybridization Incubator
Tool
Robbins Scientific
M1000
Pyrex dish (2)
Tool
Watchmaker’s glass 50mm
Tool
VWR
66112-060
Glass rings
Tool
Physical Plant facility
cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish.
Curved Forceps (1)
Surgery
Electron Microscopy Sciences
72991-4C
Forceps (2)
Surgery
Fine Science Tools
11002-13
blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil
Sharpening Stone Dan’s Black Arkansas
Surgery
Electron Microscopy Sciences
62082-00
Fine scissors
Surgery
Fine Science Tools
14161-10
Plastic dishes
Tool
Falcon
353001
Rubber Bulb
Tool
Electron Microscopy Sciences
70980
Pasteur Capillary Pipette
Tool
Electron Microscopy Sciences
70950-12
round edge under flame
Microcapillary tube
Surgery
Sigma
P1049-1PAK
Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps
Microdissecting knife
Surgery
Fine Science Tools
10056-12
Use to puncture cavities prior to in situ hybridization
Minuten pins 0.2mm diam
Surgery
Fine Science Tools
26002-20
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base
Reagent
Dow Corning
0001986475
Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C