Summary
Deze video toont twee-kleuren ganse berg in situ hybridisatie, een methode waarmee de ruimtelijke en temporele expressie patroon van twee verschillende genen kunnen worden gevisualiseerd in jonge kippenembryo's. Deze methode werd oorspronkelijk geïntroduceerd door David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham en David Ish-Horowicz.
Abstract
Het kuiken embryo is een waardevol instrument in de studie van de vroege embryonale ontwikkeling. De transparantie, toegankelijkheid en het gemak van manipulatie, maken het een ideaal hulpmiddel voor het bestuderen van genexpressie in de hersenen, neurale buis, somiet en hart primordia vorming. Deze video toont de verschillende stappen in 2 kleuren ganse berg in situ hybridisatie, Ten eerste is de embryo wordt ontleed door het ei en gefixeerd in paraformaldehyde. Ten tweede, is het embryo verwerkt voor prehybridisatie. Het embryo wordt vervolgens gehybridiseerd met twee verschillende probes, gekoppeld aan een DIG, en een gekoppeld aan FITC. Na 's nachts hybridisatie, is het embryo geïncubeerd met DIG gekoppeld antilichaam. Kleur reactie voor DIG substraat wordt uitgevoerd, en de regio van belang lijkt blauw. Het embryo wordt vervolgens geïncubeerd met FITC gekoppeld antilichaam. Het embryo wordt verwerkt voor de kleurreactie met FITC, en de regio van belang lijkt rood. Tot slot wordt het embryo vast en verwerkt voor phtograph en snijden. Een gids is het oplossen van problemen ook gepresenteerd.
Protocol
Deel 1: Het bevestigen van de embryo's
- Vul dissectie schaal met ijskoud DEPC-PBS. Te houden op het ijs. Open het ei door te tikken op de schaal met een tang en verwijder de schil stukken.
- Verwijder de dikke albumine met een pincet. Tilt dooierzak met grof tang zodat embryo naar boven wijst.
- Met behulp van een schaar, knip een vierkant van dooierzak rond het embryo.
- Met behulp van lepel, verwijder embryo van de dooier en de plaats op ijskoud DEPC-PBS.
- Onder de microscoop, verwijder membranen en dooier en transfer naar fixatie schotel.
- Vastpinnen, verwijder DEPC-PBS. Vervangen met 4% PFA in DEPC-PBS en fix O / N bij 4 ° C.
- Verwijderen fixeermiddel. Vervangen met ijskoud DEPC-PBS. Met behulp van een stomp uiteinde microcapillaire naald of een microdissectie mes, perforeren het zenuwstelsel en het hart holten, te vangen van sonde te voorkomen.
- Was de 2x 10 minuten DEPC-PBS met 0,1% Tween-20 (PBT). Uitdrogen 10 minuten elk in 25%, 50%, 75% methanol in PBT. Twee keer uitdrogen embryo's in 100% methanol. Bewaren bij -20 ° C in methanol.
Deel 2: prehybridisatie
- Hydrateren embryo's 10 minuten elk in 75%, 50% en 25% methanol in PBT. Was de 2x 10 minuten in de PBT.
- Ondertussen bereiden ijskoud fixatief (4% paraformaldehyde in PBT). Vervangen door PBT met proteinase K oplossing (3 ml / flacon; [? 5 g / ml] finale in PBT). Zorg ervoor dat de gehele flacon wordt blootgesteld aan proteinase K oplossing door zacht glooiende de flacon, zie Problemen oplossen voor belichtingstijden.
- Met behulp van RNase vrij Pasteur pipet verwijderen proteinase K en voeg fixatief (2 ml). Direct plaats op ijs precies 20 minuten.
- Alle RT wast zijn uitgevoerd op nutator. Was de 2x 10 minuten in PBT, en 1x 10 minuten in PBT die 50% hybridisatiebuffer.
- Was 1x in hybridisatiebuffer. Incubeer bij 65 ° C in 2 ml hybridisatiebuffer voor 4-5 uur.
Deel 3: hybridiseren embryo's met sondes
- DIG en FITC gekoppeld sonde synthese wordt beschreven in Appendix. De sonde zal naar verwachting een sterk signaal te geven, moet worden synhesized met FITC-bevattende nucleotiden, de zwakkere sonde moet worden gesynthetiseerd met een met een DIG-bevattende nucleotiden.
- Voorverwarmen probes in hybridisatiebuffer (500 ng / ml elk) met behulp van een 2 ml flacon. Onmiddellijk vervangen van de hybridisatiebuffer met de probe-oplossing. Laat de embryo's drogen. Incubeer 16 uur bij 65 ° C.
- Vervang de sonde met hybridisatiebuffer, 2 wassen, 30 minuten elk bij 65 ° C. Was de 15 minuten in hybridisatiebuffer / MABT (1 / 1 v / v /) bij 65 ° C.
Deel 4: DIG antilichaam incubatie en kleurreactie
- Was 2x20 MN in MABT. Was 1 uur in 2% BBR / MABT. Was 5 uur in 2% BBR/20% HISS / MABT (blokkerende buffer). Incubeer in 1:2000 DIG antilichaam verdund in het blokkeren van buffer, O / N bij 4 ° C op nutator.
- Was 3x 10 minuten elk in MABT, en 3x een uur elk in MABT.
- Was de 2x 20 minuten in NTMT. Voeg 200ul NBT / BCIP ondergrond tot 10 ml NTMT. Onmiddellijk verwijderen NTMT van de flacon en vervang met 1-2 ml NBT / BCIP buffer. Plaats in het donker. Monitor kleur reactie na 20 minuten, en op 20 minuten tussenpozen.
- Volgende kleur reactie (moeten verschijnen blauw), wassen in PBS gedurende 10 minuten, vastpinnen op fixatie schaal gevuld met PBS, en vervang oplossing met 4% PFA in PBS. Fix O / N bij 4 ° C.
- Transfer naar nieuwe scintillatieflesje. Was in PBST (PBS met 1% Tween-20) 2x10 minuten. Was in MABT 2x 10 minuten.
- Incubeer in MABT 30 minuten op 63 ° C.
Deel 5: FITC antilichaam incubatie en kleurreactie
- Was de 2x 10 minuten in MABT, 1 uur in 2% BBR / MABT, 5 uur in het blokkeren van buffer
- Incubeer in alkalische fosfatase-gekoppelde anti-FITC-antilichaam (1:500) O / N bij 4 ° C.
- Was 3x 10 minuten elk in MABT, en 3x een uur elk in MABT.
- Was in 2x 20 minuten in TBS pH 8,45 met 0,1% Tween-20 (TBST).
- Bereid Vector Red werkende oplossing (5 ml) in TBST met behulp van reagentia 1,2 en 3 die in kit. Onmiddellijk verwijderen TBST van de flacon en te vervangen door Vector Red buffer. Plaats in het donker. Monitor kleur reactie na 40 minuten, en op 30 mn tussenpozen.
- Volgende kleur reactie (moeten verschijnen rood), transfer embryo's PBS.
Deel 6: Bevestiging en verwerking
- Transfer naar fixatie schaaltje met PBS, en vast te stellen 4% PFA voor 20 minuten op RT of O / N bij 4 ° C.
- Wassen in PBS, 2x 10 minuten. Te verwerken voor fotografie, transfer naar 20% glycerol in PBS (dit maakt de embryo's doorzichtig). Voor het maken van een kamer, knip 2 strips van PVC-tape, superponeren ze op dia. Knip een plein in het centrum met behulp van een mes. Verwijder het plein met behulp van pincet.
- Te verwerken voor de wax snijden, transfer terug naar PBS, wassen 2x 10 minuten, dehydrateren in gegradeerde serie van methanol (25%, 50%, 75% en 100% in PBS, op 10 minuten elk).
- Vervangen door propanol, 3mn. Vervangen door 1,2,3,4-tetrahydronaftaleen, 20 minuten gevolgd door Histoclear (2x 1 uur). Vervangen met histoclear / was 1 / 1 (v / v) 60 ° C gedurende 1 uur. Vervangen met was een procesvoor histologie.
Deel 7: Oplossingen
Hybridisatiebuffer, bewaren bij -20 ° C in Falcon, 50 ml: 25 ml formamide, 3,25 ml (20xSSC), 0,5 ml (0,5 M EDTA), 1 ml (10% Tween-20), 2,5 ml (1% SDS) ; 125 ul (20mg/ml tRNA). 100ul (50 mg / ml heparine) MABT, voor te bereiden 100mm maleïnezuur, pH op 7,5 met NaOH pellets. Voeg 150mm NaCl en 0,1% Tween-20.
NTMT (gemaakt vlak voor gebruik), 50 ml: 1 ml (5M NaCl), 2,5 ml (2M Tris-HCl pH9.5), 1,25 ml (2M MgCl 2), 5 ml (10% Tween-20).
TBST: 0,1 M Tris-HCl, 0,15 M NaCl, pH 8,45, 0,1% Tween-20.
Deel 8: het oplossen van problemen
| Probleem | Veroorzaken | Remedie |
|---|---|---|
| Embryo is opgerold | Onvoldoende uitdroging / rehydratie | Onderhouden 10 mn intervallen tijdens de opeenvolgende uitdroging / rehydratie stappen |
| Er is geen probe-signaal | Probe wordt afgebroken RNase verontreiniging in flacon | Run probe op 1% agarosegel Zorg ervoor dat de gehele flacon wordt blootgesteld om proteïnase K-oplossing in stap 2 |
| Sonde is labels holten van het hart een neurale buis | Sonde wordt gevangen | In stap 2, ervoor zorgen dat alle holtes zijn geperforeerd met microdissectie mes of microcapillaire |
| Embryo uiteengevallen na hybridisatie (stap 3) | Proteinase K stap naar links te lang Hybridisatie temperatuur is te hoog | Proteinase K mag niet langer zijn dan 1mn worden gelaten (fase 3 + en 4), 2 minuten (fase 5 tot 7), 3 minuten (fase 8-10), 4 mn (stadium 11-13) Niet hybridiseren bij T o hogere dan 65 o C |
Deel 9: representatieve resultaten
Vertegenwoordiger van embryo's worden hieronder weergegeven: (A) Embryo (fase HH7) is voorzien van een DIG-Sox sonde (blauw) en een FITC-delta-1 sonde (rood). (B) Embryo (fase HH8) is voorzien van een DIG-PAX6 sonde (blauw) en een FITC-Shh probe (rood). Nf, neurale vouwen, ANP, anterior neurale plaat, psm, presomitic mesoderm, n, notochord, nt, neurale buis). Probe giften van de laboratoria van Drs. C. Tabin, M. Goulding, D. Henrique, en J. Briscoe. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De twee-kleuren ganse berg in situ hybridisatie methode wordt gebruikt om zowel de ruimtelijke en temporele patronen van genexpressie te bepalen, met behulp van een of twee genen van belang. Toepassingen zijn onder andere de beoordeling van genexpressie patronen van nieuwe genen (bijvoorbeeld 1,2, evenals veranderingen in genexpressie na belediging (embryonale manipulaties 3, 4 kralen, en elektroporatie van RNA-of DNA-constructen 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Margaret M. Alkek Stichting RHF.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 | |
| Marsh Automatic Incubator | Tool | Lyon | RX | |
| Hybridization Incubator | Tool | Hybaid | Micro-4 | |
| Adams Nutator orbital mixer | Tool | Fisher Scientific | 14-062 | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Spoon | Tool | Fine Science Tools | 10370-18 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | ||
| Microcapillary tube | Sigma-Aldrich | P1049-1PAK | Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps | |
| Microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization | |
| Minuten pins 0.2mm diam | Fine Science Tools | 26002-20 | Keep pins together using a magnetic stirrer; | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave |
| 16% PFA | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Tween-20 | Reagent | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308-5MG | Stock at 10 mg/ml in depc-H2O in 10ul aliquots. Store at -20C. | |
| Formamide, deionized | Reagent | Ambion | 9342 | |
| Yeast tRNA-25 mg | Reagent | Invitrogen | 15401-011 | Stock at 20 mg/ml in depc-H2O in 125ul aliquots. Store at -20C |
| Heparin Sodium salt | Reagent | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | Stock at 50 mg/ml in depc-H2O in 100ul aliquots. Store at -20C. |
| SSC x20 pH5.5 | Reagent | Fisher Scientific | PR-V4261 | |
| EDTA (0.5M) | PR-V4231 | Fisher Scientific | ||
| SDS | Reagent | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| Maleic acid | Reagent | Fluka | 63189 | |
| B–hringer Blocking Reagent | Reagent | Roche Group | 11096176001 | Use at 2% in MABT. To make, heat with MABT for 20 mn at 60C. Can make a stock and store in 1-5 ml aliquots at 20C. |
| Heat inactivated sheep serum | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 013-000-121 | Dissolve in 10 ml H2O; heat 550C, 30 mn. Aliquot at 1ml, -20C. |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Reagent | Roche Group | 11093274910 | |
| NBT/BCIP stock solution | Reagent | Roche Group | 11681451001 | |
| Anti-Fluorescein-AP, Fab fragments | Reagent | Roche Group | 11426338910 | |
| 2M Tris | BP1759-500 | Fisher Scientific | ||
| Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit | Reagent | Vector Laboratories | SK-5100 | |
| 1,2,3,4-tetrahydronaphthalene | Reagent | Sigma-Aldrich | 429325-100ML | Under hood |
References
- Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. 406, 74-78 (2000).
- Rodríguez Esteban, C., Capdevila, J., Economides, A. N., Pascual, J., Ortiz, A., Izpisúa Belmonte, J. C. The novel Cer-like protein Caronte mediates the establishment of embryonic left-right asymmetry. Nature. 401, 243-251 (1999).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Kawakami, M., Nakanishi, N. The role of an endogenous PKA inhibitor, PKIalpha, in organizing left-right axis formation. Development. 128, 2509-2515 (2001).
- Basch, M. L., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. I. Specification of the neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).
