Summary
Bu video in situ hibridizasyon, 2 farklı genler mekansal ve zamansal ifade desen genç civciv embriyolarında görüntülenebilmekte hangi bir yöntem 2-renk tüm montaj göstermektedir. Bu yöntem başlangıçta David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham ve David Ish-Horowicz tarafından tanıtıldı.
Abstract
Civciv embriyo erken embriyonik gelişim çalışmaya değerli bir araçtır. Şeffaflık, erişilebilirlik ve manipülasyon kolaylığı, beyin, nöral tüp, hücre gruplarının ve kalp primordia oluşumu gen ekspresyonu çalışmak için ideal bir araçtır. Bu video 2-renk tüm montaj in situ hibridizasyon farklı adımları gösteriyor; İlk yumurta, embriyo disseke ve paraformaldehid sabit. İkincisi, embriyo prehybridization için işlenir. Embriyo daha sonra iki farklı probları, DIG akuple bir FITC akuple melezleşmiştir. Gecede hibridizasyon, embriyo DIG birleştiğinde antikor ile inkübe edilir. DIG substrat için renk reaksiyonu ve ilgi bölge mavi görünür. Embriyo daha sonra FITC birleştiğinde antikor ile inkübe edilir. Embriyo FITC ile renk reaksiyonu için işlenir ve ilgi bölge kırmızı görünür. Son olarak, embriyo, sabit ve işlenmiş phtograph ve kesit. Bir sorun giderme kılavuzu da sunulmaktadır.
Protocol
Bölüm 1: embriyoların Tespit
- Buz depc-PBS ile diseksiyon çanak doldurun. Buz üzerinde tutun. Forseps ile kabuk dokunarak açın ve yumurta kabuğu parçaları çıkarın.
- Forseps ile albümin kalın çıkarın. Kaba forseps ile yumurta sarısı kesesi, embriyo yukarı bakacak şekilde yatırın.
- Makas kullanarak, yolk kesesi embriyo etrafında bir kare kesti.
- Kaşık kullanarak, buz depc-PBS sarısı ve yerden embriyo çıkarın.
- Mikroskop altında, membranlar ve yumurta sarısı kaldırmak ve fiksasyon çanak transfer.
- Pin depc-PBS kaldırmak. Depc-PBS içinde% 4 PFA ile değiştirin ve 4 O / N düzeltmek ° C
- Fiksatif çıkarın. Buz depc-PBS ile değiştirin. Künt sonuna microcapillary iğne veya mikrodiseksiyon bıçak kullanarak, probun yakalama önlemek için, sinir sistemi ve kalp boşluklarında perfore.
- 2x 10 milyon depc-PBS% 0.1 Tween-20 (PBT) ile yıkayın. ,% 25,% 50, PBT% 75 metanol her 10 milyon dehydrate. % 100 metanol içinde iki kez embriyolar dehydrate. Metanol -20 ° C'de saklayın.
Bölüm 2: Prehybridization
- % 75,% 50 ve% 25 PBT metanol her embriyoların 10 milyon rehidrate. PBT 2x 10 milyon yıkayın.
- Bu arada, buz, soğuk fiksatif (PBT içinde% 4 paraformaldehid) hazırlar. Proteinaz K çözüm ([5 g / ml] son PBT 3 ml / flakon) PBT değiştirin. Tüm flakon flakon hafifçe yuvarlayarak proteinaz K çözüm için açık olduğundan emin olun; pozlama süreleri için bkz Sorun Giderme.
- RNaz ücretsiz Pasteur pipeti kaldır proteinaz K kullanma ve fiksatif (2 ml) ekleyin. Tam 20 milyon için hemen buz üzerine yerleştirin.
- Tüm RT yıkar nutator yapılmaktadır. 2x PBT 10 milyon ve% 50 hibridizasyon tamponu içeren PBT 1x 10mn yıkayın.
- Hibridizasyon tamponu 1x yıkayın. 65 inkübe ° C 4-5 saat için 2 ml hibridizasyon tamponu.
Bölüm 3: problar ile melez embriyolar
- DIG ve Ek FITC birleştiğinde prob sentezi açıklanmıştır. Güçlü bir sinyal vermek için beklenen probu, FITC içeren nükleotidler synhesized; zayıf prob DIG içeren nükleotidler ile sentezlenmiş olmalıdır.
- 2 ml flakon kullanarak hibridizasyon tamponu Prewarm probları (500 ng / ml). Derhal, prob çözüm ile hibridizasyon tamponu değiştirin. Embriyoların kuru izin vermeyin. 65 yaşında 16 saat inkübe ° C.
- Prob hibridizasyon tamponu, 2 yıkar, 30 milyon 65 ° C ile değiştirin. 65 (1 / 1 v / v /) hibridizasyon tamponu / MABT 15 milyon yıkayın ° C
Bölüm 4: DIG antikor kuluçka ve renk reaksiyonu
- MABT 2x20 milyon yıkayın. 1 saat içinde% 2 BBR / MABT yıkayın. % 2% 5 saat yıkayın BBR/20 HISS / MABT (tampon engelleme). Engelleme tampon seyreltilmiş 1:2000 DIG antikor inkübe, 4 O / N ° C nutator üzerinde.
- MABT içinde 3x 10 milyon, her biri 1 saat ve 3x MABT içinde her yıkayın.
- NTMT 2x 20 milyon yıkayın. 10 ml NTMT 200ul NBT / BCIP substrat ekleyin. Hemen şişeden NTMT kaldırın ve 1-2 ml NBT / BCIP tampon ile değiştirin. Karanlıkta koyun. 20 dk sonra renk reaksiyonu Monitör, ve bundan sonraki 20 milyon aralıklarla.
- Renk reaksiyonu (mavi görünmelidir), 10 milyon için PBS içinde yıkayın PBS ile dolu fiksasyon çanak aşağı pin ve PBS içinde% 4 PFA çözüm yerine. 4 O / N ° C Fix
- Yeni sintilasyon flakon aktarın. 2x10 milyon (PBS)% 1 Tween-20 PBST yıkayın. MABT 2x 10 milyon yıkayın.
- 63 ° C'de MABT 30 milyon inkübe
Bölüm 5: FITC antikor kuluçka ve renk reaksiyonu
- Yıkama MABT 2x 10 milyon,% 2 1 saat, 5 saat engelleme tampon BBR / MABT
- Alkalen fosfataz çiftli anti-FITC-antikor (1:500) O / N 4 ° C de inkübe
- MABT içinde 3x 10 milyon, her biri 1 saat ve 3x MABT içinde her yıkayın.
- TBS pH 8.45 ile% 0.1 Tween-20 (TBST) 2x 20 milyon yıkayın.
- Vektör Kırmızı çalışma solüsyonu (5 ml) TBST kitinde reaktifler 1,2 ve 3 ile hazırlayın. Hemen şişeden TBST kaldırmak ve Vektör Kırmızı tamponu ile değiştirin. Karanlıkta koyun. 40 milyon renk reaksiyonu sonra ve daha sonra 30 milyon aralıklarla izleyin.
- Aşağıdaki renk reaksiyonu (kırmızı görünmelidir), PBS için embriyoların transferi.
Bölüm 6: Fiksasyon ve işleme
- PBS içeren fiksasyon çanak Transfer ve 4 RT veya O / N 20 milyon için% 4 PFA düzeltmek ° C.
- PBS, 2x 10 milyon yıkayın. Fotoğrafçılığı için işlemek için, PBS içinde% 20 gliserol (bu embriyolar saydam hale getirecek) transfer. Bir oda oluşturmak için, slaytta bunları üst üste, 2 PVC bant şeritler kesin. Merkezi bir bıçak kullanarak bir kare kesin. Kare kullanarak forseps çıkarın.
- Balmumu kesit için işlemek için, metanol kademeli serisi (% 25,% 50,% 75 ve% 100 PBS, her biri 10 milyon) kurutmak, PBS, yıkama 2x 10 milyon transferi geri.
- Propanol, 3dk ile değiştirin. 1,2,3,4-tetrahydronaphthalene ile değiştirin, 20 milyon Histoclear (2x 1 saat) izledi. 1 saat histoclear / balmumu 1 / 1 (v / v) 60 ° C ile değiştirin. Balmumu bir süreç ile değiştirin.histoloji için.
Bölüm 7: Çözümler
Hibridizasyon tamponu, mağaza -20 ° C Falcon 50 ml: 25 ml formamid; 3.25 ml (20xSSC); 0,5 ml (0,5 M EDTA), 1 ml (% 10 Tween-20), 2.5 ml (% 1'lik SDS) 125 ul (20mg/ml tRNA); 100ul (50 mg / ml heparin) MABT, 100 mM maleik asit hazırlamak, pH 7.5 NaOH ttaneli. 150mm NaCl ve% 0.1 Tween-20 ekleyin.
NTMT kullanımdan hemen önce, 50 ml: 1ml (5M NaCl), 2.5 ml (2M Tris-HCl pH9.5), 1.25 ml (2M MgCl 2), 5 ml (% 10 Tween-20).
TBST: 0.1M Tris-HCl, 0.15m NaCl, pH 8.45,% 0.1 Tween-20.
Bölüm 8: Sorun Giderme
| Sorun | Neden | Çare |
|---|---|---|
| Embriyo kadar kıvrılmış | Yetersiz dehidratasyon / rehidrasyon | Ardışık dehidratasyon / rehidrasyon adımları sırasında 10 milyon aralıklarla koruyun |
| Prob sinyali yok | Probe flakon parçalanır RNaz kirlenme | % 1 agaroz jel üzerinde prob çalıştırın tüm flakon adım 2 Proteinaz K çözüm maruz olduğundan emin olun. |
| Probe etiketler kalp boşlukları bir nöral tüp | Probe sıkışıp | 2. adımda, delikli mikrodiseksiyon bıçak kullanarak tüm boşluklar olduğundan emin olun veya microcapillary |
| Embriyo aşağıdaki hibridizasyon (adım 3) parçalandı | Proteinaz K adım çok uzun Hibridizasyon sıcaklığı çok yüksek sol | Proteinaz K 2 milyon (evre 5 ila 7), 3 milyon (evre 8-10), 4 milyon (evre 11-13), (evre 3 ve 4) 1dk daha uzun bırakılmalıdır olmamalıdır yüksek T o melezleşme etmeyin 65 ° C daha |
Bölüm 9: Temsilcilik Sonuçlar
Temsilcisi embriyolar aşağıda gösterilmiştir: (A) Embriyo (evre HH7) DIG-Sox prob (mavi) ve bir FITC-delta-1 probu (kırmızı) ile etiketlenir. (B) Embriyo (evre HH8) DIG Pax6 prob (mavi) ve FITC Shh probu (kırmızı) ile etiketlenir. Nf, sinir kat, ANP, ön nöral plaka, PSM, presomitic mezoderm, n, notokord nt, nöral tüp). Dr, laboratuvarların Probe hediyeler. C. Tabin, M. Goulding, D. Henrique, ve J. Briscoe. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In situ hibridizasyon yöntemi 2-renk tüm montaj, ilgi duyulan bir ya da iki gen, gen ekspresyonu mekansal ve zamansal desenler belirlemek için kullanılır. Uygulamalar yeni genlerin gen ekspresyonu değerlendirilmesi (örneğin 1,2 yanı sıra, gen ekspresyonu aşağıdaki hakaret değişiklikler (embriyonik manipülasyonlar 3, boncuk 4, ve RNA veya DNA elektroporasyon 5 oluşumlar) içerir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma, Margaret M. RHF Alkek Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 | |
| Marsh Automatic Incubator | Tool | Lyon | RX | |
| Hybridization Incubator | Tool | Hybaid | Micro-4 | |
| Adams Nutator orbital mixer | Tool | Fisher Scientific | 14-062 | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Spoon | Tool | Fine Science Tools | 10370-18 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | ||
| Microcapillary tube | Sigma-Aldrich | P1049-1PAK | Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps | |
| Microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization | |
| Minuten pins 0.2mm diam | Fine Science Tools | 26002-20 | Keep pins together using a magnetic stirrer; | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave |
| 16% PFA | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Tween-20 | Reagent | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308-5MG | Stock at 10 mg/ml in depc-H2O in 10ul aliquots. Store at -20C. | |
| Formamide, deionized | Reagent | Ambion | 9342 | |
| Yeast tRNA-25 mg | Reagent | Invitrogen | 15401-011 | Stock at 20 mg/ml in depc-H2O in 125ul aliquots. Store at -20C |
| Heparin Sodium salt | Reagent | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | Stock at 50 mg/ml in depc-H2O in 100ul aliquots. Store at -20C. |
| SSC x20 pH5.5 | Reagent | Fisher Scientific | PR-V4261 | |
| EDTA (0.5M) | PR-V4231 | Fisher Scientific | ||
| SDS | Reagent | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| Maleic acid | Reagent | Fluka | 63189 | |
| B–hringer Blocking Reagent | Reagent | Roche Group | 11096176001 | Use at 2% in MABT. To make, heat with MABT for 20 mn at 60C. Can make a stock and store in 1-5 ml aliquots at 20C. |
| Heat inactivated sheep serum | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 013-000-121 | Dissolve in 10 ml H2O; heat 550C, 30 mn. Aliquot at 1ml, -20C. |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Reagent | Roche Group | 11093274910 | |
| NBT/BCIP stock solution | Reagent | Roche Group | 11681451001 | |
| Anti-Fluorescein-AP, Fab fragments | Reagent | Roche Group | 11426338910 | |
| 2M Tris | BP1759-500 | Fisher Scientific | ||
| Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit | Reagent | Vector Laboratories | SK-5100 | |
| 1,2,3,4-tetrahydronaphthalene | Reagent | Sigma-Aldrich | 429325-100ML | Under hood |
References
- Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. 406, 74-78 (2000).
- Rodríguez Esteban, C., Capdevila, J., Economides, A. N., Pascual, J., Ortiz, A., Izpisúa Belmonte, J. C. The novel Cer-like protein Caronte mediates the establishment of embryonic left-right asymmetry. Nature. 401, 243-251 (1999).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Kawakami, M., Nakanishi, N. The role of an endogenous PKA inhibitor, PKIalpha, in organizing left-right axis formation. Development. 128, 2509-2515 (2001).
- Basch, M. L., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. I. Specification of the neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).
