L'aide de pincettes laser pour la manipulation neurones isolés in vitro

Summary

Cette vidéo décrit la manipulation des neurones cultivés en utilisant le laser pincettes in vitro.

Abstract

Dans ce papier et vidéo, nous décrivons les protocoles utilisés dans notre laboratoire pour étudier les préférences de ciblage des processus régénérant cellulaire des neurones rétiniens adultes in vitro. Procédures pour préparer des cultures de cellules rétiniennes commencer par la dissection, la digestion et la trituration de la rétine, et se terminent avec le placage de cellules rétiniennes isolées sur des plats spécialement conçus pour une utilisation avec pinces optiques. Ces plats sont divisés en une demi adhésion cellulaire et demi répulsif cellule. Le côté adhésif cellule est recouverte d'une couche de Sal-1 anticorps, qui fournissent un substrat sur lequel les cellules de notre croissance. D'autres substrats adhésif pourrait être utilisé pour d'autres types cellulaires. Le côté répulsif cellule est recouverte d'une fine couche de poly-HEMA. Les cellules étalées sur le côté poly-HEMA du plat sont piégés avec la pince à épiler au laser, transporté et placé à proximité d'un cellulaire sur la Sal-1 côté pour créer une paire. Formation des groupes de cellules de n'importe quelle taille devrait être possible avec cette technique. «Laser-pincette contrôlée micromanipulation» signifie que le chercheur peut choisir lequel les cellules à se déplacer, et la distance souhaitée entre les cellules peuvent être standardisés. Parce que le faisceau laser passe à travers des surfaces transparentes de la boîte de culture, la sélection de cellules et de placement sont effectués dans un espace clos, environnement stérile. Les cellules peuvent être surveillés par vidéo time-lapse et utilisé avec n'importe quelle technique de biologie cellulaire nécessaires. Cette technique peut aider les enquêtes sur les interactions cellule-cellule.

Protocol

Pinces optiques permettant de manipuler des cellules isolées en culture

Les forces de piégeage des pinces optiques sont générées à partir de l'élan de la lumière (Ashkin, 1991;. Ashkin et al, 1986). Bien que ces forces facilement piéger les cellules en suspension, ils ne sont pas en mesure de déplacer des cellules qui adhèrent à une surface. Par conséquent, pour réduire l'adhérence de la boîte de culture à l'endroit où les cellules sont piégées, la lamelle est enduit avec de la poly-2-hydroxyéthylméthacrylate (poly-HEMA) (Sigma Chemical Co., St Louis, MO), un composé non toxique aux cellules répulsif propriétés précédemment employé pour les études de l'adhérence sur les cellules endothéliales (Folkman et Moscona, 1978). Alors que le poly-HEMA couvre la moitié de la boîte de culture, l'autre moitié est recouvert d'un substrat qui supporte la croissance cellulaire. Dans notre laboratoire, Sal-1 est utilisé comme substrat pour les cellules de la rétine de salamandre culture. La procédure pour la fabrication de Sal-1 et poly-HEMA plats enduit est décrit ci-dessous:

Fabrication de boîtes de culture

1. Coverglasses propre (# 1 VWR Scientific Inc, Media, PA) dans l'acide. Cette lamelle a été sélectionné pour son épaisseur de seulement 0.1mm, nécessaires pour atteindre les objectifs de haute ouverture numérique nécessaire pour la focalisation du laser.
2. Pour créer une zone de cellules répulsif, dissoudre 20 mg de poly-HEMA (Sigma Chemical Co., St Louis, MO) dans 1 ml d'éthanol à 95% pendant une nuit à température ambiante. De préférence, cette solution doit être utilisée dans un mois de préparation.
3. Caler l'coverglasses à une position presque verticale dans un environnement exempt de poussière, comme un capuchon.
4. Placez une ou deux gouttes de solution de poly-HEMA près du sommet de la lamelle de la pointe en plastique d'une micropipette 200 pl. Les gouttes (environ 50 100 pi-chacun) devrait être limité à la moitié de la lamelle. La pente raide assure que le liquide coule de la surface du couvre-objet au fond, fournissant un enduit mince voire de poly-HEMA. Laisser le coverglasses poly-HEMA revêtement à sécher dans la hotte pendant 30-60 minutes à température ambiante.
5. Marquer le côté poly-HEMA de l'lamelle avec un stylo à pointe fine près du bord.
6. Percez un trou de 1 cm dans le fond d'une boîte de culture de 35 mm.
7. Collez la lamelle poly-HEMA revêtement au fond de la boîte de culture avec des Sylgard 184 (Dow Corning Co., Midland, MI) afin que le côté poly-HEMA recouvert visages vers l'intérieur du plat. S'assurer que le bord de la couche de poly-HEMA parcourt le centre du trou. Autoriser les plats à sécher pendant 1-3 jours à température ambiante dans un environnement exempt de poussière.
8. Scratch une ligne sur l'extérieur de la lamelle avec un stylo à pointe de diamant en suivant le bord du revêtement en poly-HEMA. Ensuite, gratter deux lignes se croisent à angle droit de la part d'environ 2mm. Les deux points d'intersection servir de référence ou des points de repères à utiliser pour reproduire la même orientation de l'antenne de la culture sur la platine du microscope.
9. Stériliser les plats sous la lumière ultraviolette pendant la nuit.
10. Pour créer une demi-pile-adepte de la boîte de culture, le manteau de la non poly-HEMA moitié avec Sal-1, qui contient une souris anti-salamandre anticorps dirigé contre les membranes des cellules rétiniennes (généreusement fourni par le Dr Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine , Atlanta, GA, voir MacLeish et al (1983)).. Premièrement, le manteau de la Sal-1 à côte avec environ 100 pi de 0,1 mg / ml stériles de chèvre anti-IgG de souris (Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis IN), en prenant soin de ne pas renverser le liquide sur sur le côté poly-HEMA. Laisser pendant trois heures, puis l'enlever. Laver la même zone avec une solution Ringer stérile une fois ou deux, puis placez 100 ul Sal-1 surnageant, en prenant soin de ne pas renverser le liquide dans le côté poly-HEMA du plat. Le premier anticorps assure Sal-1 est enduit à une concentration connue.
11. Incuber les plats avec la nuit Sal-1.
12. Retirer la solution Sal-1 anticorps et rincer la zone avec une solution Ringer stérile. Introduisez 2 ml de milieu à l'antenne juste avant le placage cellule.

La composition de la solution de Ringer amphibien, un milieu sans sérum d'amphibiens, et la solution de Ringer pour la digestion enzymatique sont trouvés dans MacLeish et Townes-Anderson (1988) et Mandell et al. (1993).

Préparation des cultures de cellules

Les cellules utilisées dans cette vidéo ont été tirées de la lumière adaptée, des adultes, aquatiques phases de tigre salamandres (Ambystoma tigrinum), mesurant de 17 à 22 cm de longueur (Charles Sullivan Inc, Nashville, TN), maintenu à 5 ° C sur un 12 h: 12 h cycle lumière-obscurité. Les protocoles ont été approuvés par l'Institutional Animal Care et utilisation comité (IACUC) à l'Université de médecine et de dentisterie du New Jersey en stricte conformité avec les directives du National Institutes of Health. Les procédures de préparation des cultures de cellules rétiniennes sont décrits par Nachman-Clewner et Townes-Anderson (1996) et sont comme suit:

1. Décapiter et la moelle des animaux. Retirez les yeux et disséquer les cornées et d'iris. Les rétines doit se détacher légèrement dans l'œilleton. En plaçant une pince courbe sous la rétine, évider les rétines. Il n'est pas important si la lentille est attaché à la rétine à ce stade.
2. Digest de la rétine dans 14 U / ml papaïne (Worthington, Freehold, New Jersey) dans une solution de Ringer salamandre pendant 40 minutes.
3. Avant l'utilisation, la solution de Ringer papaïne devrait faire barboter avec 95% O ₂ / 5% de CO ₂ de gaz pendant 30 min., Puis stérilisés par passage à travers un filtre de 0,22 micron (Millipore, Carrigtwohill, Irlande).
4. Rincez les rétines avec une solution stérile de la salamandre de Ringer à trois reprises.
5. Retirer les lentilles de la solution du Ringer, puis doucement triturer les tissus rétiniens avec un alésage de 3 mm pipette pour obtenir une suspension cellulaire.

Laser pinces de manipulation de neurones isolés

1. Placer le plat de culture sur la platine du microscope, en orientant le plat en alignant une marque sur le plat avec un point de référence sur la scène. Enregistrer les coordonnées des points de repères dans l'ordinateur.
2. Cellules de la plaque sur les deux Sal-1 et poly-HEMA moitiés du plat.
3. Permettre aux cellules de se contenter d'environ 20 minutes, ce qui est assez long pour les cellules adhérentes sur le côté du plat à joindre au substrat d'anticorps.
4. Sélectionnez une cellule sur le côté de Sal-1 adhérente du plat. Marquer le x et le stade y les coordonnées d'une position proche de la cellule. Dans notre cas, le point a été d'environ 10 microns des dendrites primaires de la cellule sélectionnée. Enregistrer les coordonnées dans l'ordinateur.
5. Sélectionnez un deuxième neurone, dans notre cas un photorécepteur, sur le côté poly-HEMA du plat et utilisez l'outil pince au laser pour le piéger. Le piégeage peut être réalisé sur une large gamme de niveaux de puissance. Toutefois, nous avons mis la puissance du laser à 10% -20%, ce qui est assez bas pour éviter les débris piégeage avec la cellule, mais suffisante pour le transport de la cellule par l'intermédiaire.
6. Tout en maintenant la cellule dans le piège, baissez le stade de sorte que la cellule est bien au-dessus de la surface de la boîte de culture et surtout toute neurones attachés. Déplacer le stade sous contrôle informatique pour apporter à la cellule de l'précédemment enregistré coordonnées x et y sur la Sal-1 côté. Le mouvement scénique a été fixé à 8-20μm / s, mais la vitesse maximale doit être déterminée empiriquement. A l'arrivée au point de destination sur le Sal-1 côté, soulevez le stade pour apporter la cellule piégée à la surface du plat. Le placement de cellules peuvent être faites avec une précision de quelques microns. Permettre à la cellule d'adhérer à la Sal-1 substrat.
7. Obtenir des images numérisées de deux cellules de la paire avant et après la formation de paires fournit un compte rendu utile.
8. Maintenir les paires de cellules dans un incubateur. Pour les cellules de salamandre, placer la vaisselle dans une chambre humidifiée à 10 ° C. Les cellules peuvent être surveillés par laps de temps la vidéo et utilisés avec n'importe quelle technique de biologie cellulaire nécessaires.

Discussion

La lumière a l'élan, et quand un rayon de lumière est réfractée lorsqu'elle passe à travers une cellule, une force est nécessaire pour changer la direction de l'élan. En raison de la loi de conservation de l'élan, une force dans la direction opposée doivent, à leur tour, réagissent à leur tour sur une cellule. Ashkin (1991) ont montré que la force générée par un faisceau laser focalisé par un objectif de microscope se déplace d'une cellule vers le centre d'intérêt. Même si un faisceau laser ne génère qu'une piconewtons quelques de la force, cette force est suffisante pour tirer une cellule grâce à moyen terme. Une longueur d'onde du proche infrarouge qui est mal absorbé par l'eau est utilisée pour éviter d'endommager la cellule (Liu et al, 1995). Le poste de travail au laser pince utilisée dans notre laboratoire (Cell Robotics Inc, Albuquerque NM) utilise un 1 W, diodes laser continu d'ondes de longueur d'onde 980nm. La lumière laser est transmis aux cellules via un objectif à immersion 40x objectif du plan neofluor d'ouverture numérique élevée (NA1.3) (Carl Zeiss Inc) qui focalise le faisceau sur le même plan focal que le microscope.

Laser-pincette contrôlée micromanipulation présente un certain nombre d'avantages par rapport aux études sur les cellules hasard plaqué. Par exemple, les cellules peuvent être placés à une distance désirée de l'autre, qui peut être normalisé pour toutes les cellules manipulées. En outre, le faisceau laser passe à travers la surface transparente de la boîte de culture et, par conséquent, la manipulation des cellules est fait dans un espace clos, environnement stérile. Les très petites forces générées par le laser impose une limite sur ce que peut être piégé. Dans notre expérience, l'adhérence et la forme des cellules sont les facteurs les plus importants limitant le piégeage succès. En général, nous piéger des cellules isolées de 10-15μm de diamètre et de transport sur des distances de plusieurs millimètres dans la boîte de culture à leur destination. Il est possible de déplacer des cellules plus grandes que celles-ci, par exemple, les cellules gliales de Müller, qui sont 20-40μm de longueur et sont les plus grandes cellules dans nos cultures.

Parce que le piégeage des cellules est un défi lorsque les cellules adhèrent au fond de verre de la boîte de culture et de l'autre, de développer une surface de la cellule-répulsif sur la lamelle à l'aide de poly-HEMA s'est révélée inestimable pour notre succès dans les cellules de la manipulation. Même ainsi, les cellules sur la surface de poly-HEMA a fini par devenir collant et difficile à manipuler dans les cultures de plus de 1-2 heures anciennes. Dans les anciennes cultures, la pratique courante dans notre laboratoire a été d'essayer de ramasser les cellules avec le laser à l'aide du réglage de la puissance maximale, puis rallumez l'appareil vers le bas pour le transport.

La facilité avec laquelle les petits objets peuvent être piégés dans le laser signifie que les débris peuvent être retirés dans le piège des distances bien en dehors de la cellule. Cela s'est avéré être un problème pendant le piégeage de nos cellules. Ceci peut être évité dans la plupart des cas, en baissant la puissance du laser au minimum possible qui peut tenir la cellule dans le piège. La vitesse à laquelle les cellules peuvent être transportés dans le piège est limité par la viscosité du milieu. Nous normalement de régler la vitesse à environ 80 à 20 um / seconde qui a été trouvé à l'intérieur d'une plage de sécurité pour le transport.

La possibilité que le laser a des effets néfastes sur les cellules tenues dans le piège doit être considérée. Dans nos cultures rétiniennes, nous rencontrons des objets sombres tels que des cellules pigmentaires qui sont détruits lorsqu'ils sont capturés dans le faisceau laser. De toute évidence, par conséquent, ces cellules ne peuvent pas être étudiés en utilisant le laser pincettes. Toutefois, dans les études précédentes sur des neurones de la rétine et les photorécepteurs réalisées dans notre laboratoire, nous n'avons trouvé aucune différence dans la croissance neuritique et la capacité à former des connexions entre les cellules pince-manipulés et les cellules non manipulées (Townes-Anderson et al 1998; Clarke et al 2008 ).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
25mm circle No.1 coverglass	VWR international	48380 080
poly-2-hydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA)	Sigma-Aldrich	P-3932	Dissolve in 95% ethanol
Goat anti-mouse IgG antibody	Chemicon International	AP181	1mg in 1ml, dilute 10x for use
Sal-1 supernatant containing mouse anti-salamander antibody	generously provided by Dr. Peter MacLeish		Dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA
3 mm bore 5ml pyrex disposable pipets	Corning	7078A-5
Cell culture dishes 35mm x 10mm	Corning	430165
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Dow Corning
Optical tweezers-microtool or laser tweezers	Cell Robotics Inc.
1 W continuous wave diode laser of 980nm wavelength	Cell Robotics Inc.
Axiovert 100 inverted light microscope	Carl Zeiss, Inc.
40x oil immersion plan neofluor objective lens	Carl Zeiss, Inc.		Numerical aperture (N.A. 1.3)
Black and white CCD camera	Sony Corporation
Computer and joystick with software	Cell Robotics Inc.		for controlling a motorized stage