גרעינים בידוד עצבי שלאחר המוות של רקמת מוח האדם

Summary

ההטרוגניות הסלולר של רקמת המוח מהווה מגבלה משמעותית לחקר סימונים epigenetic ב הכרומטין כי רוב מבחני חוסר ברזולוציה תא בודד. נוירונים הם בדרך כלל התערבבו עם גליה ולמוסדות אחרים ללא כוונת תאים עצביים. אנו מספקים פרוטוקול לחלץ ולאסוף גרעינים העצבית מהמוח האנושי.

Abstract

נוירונים במוח האנושי להיות postmitotic בעיקר במהלך התפתחות טרום לידתי, ובכך לשמור על גרעינים תוחלת החיים שלהם לאורך מלא. עם זאת, מעט מאוד ידוע על שינויים עצביים הכרומטין והארגון גרעיני במהלך התפתחות והזדקנות, או מחלה כרונית נוירופסיכיאטריות. עם זאת, עד כה מבחני מבוסס הכרומטין ביותר ו-DNA (למעט דגים) ברזולוציה יחיד חוסר התא. לשם כך, את ההטרוגניות הסלולר ניכר של רקמת המוח מהווה מגבלה משמעותית, שכן בדרך כלל subpopulations שונים של נוירונים הם התערבבו עם סוגים שונים של גליה ולמוסדות אחרים ללא כוונת תאים עצביים. אחד הפתרונות האפשריים יהיה לגדל תאים מסוג בתרבויות מסוימות, אבל רוב התאים במערכת העצבים המרכזית, כולל נוירונים, הם vivo לשעבר קיימא, במקרה הטוב, רק כמה שבועות ובכך יספק מודל שלם של מנגנוני epigenetic פוטנציאל ההפעלה ברחבי תוחלת החיים המלא . כאן, אנו מספקים פרוטוקול לחלץ ולטהר גרעינים מהמוח (לא קבוע) קפוא המוות האנושי. השיטה כוללת מיצוי של גרעיני במאגר תמוגה hypotonic, ואחריו ultracentrifugation ו immunotagging עם נוגדן אנטי NeuN. גרעינים העצבית תווית נאספים אז בנפרד באמצעות הקרינה המופעל מיון. שיטה זו צריכה לחול על כל האזור במוח במגוון רחב של מינים מתאימים ללימודי הכרומטין immunoprecipitation עם אתר ושינוי ספציפי אנטי היסטון נוגדנים, ועל מתילציה בדנ"א מבחני אחרות.

Protocol

הפקת גרעינים

1. שימי 250 מ"ג שלאחר המוות של רקמת המוח הקפוא הצפת 5 מ"ל תמוגה ¹ ב douncer ולמקם אותו על הקרח. כדי לקבל כ -5 מיליון גרעינים לאחר FACS מיון, אנחנו בדרך כלל להשתמש 1000 מ"ג של רקמת לדגימה.
2. לאחר רקמה יש להפשיר, dounce הרקמה למשך דקה 1 בעוד על הקרח.
3. קח את רקמת הומוגני ומקום אותו לתוך צינור 15 ultracentrifuge ברור מ"ל. שים את הצינור על הקרח.
4. קח 9 מ"ל של פתרון סוכרוז ² עם טפטפת, לשים את פיפטה בתחתית הצינור ultracentrifuge ברורה, לשחרר את הפתרון סוכרוז ² כדי ליצור שיפוע הריכוז עם פתרון הומוגני רקמה על גבי הפתרון סוכרוז ^2.
5. לשקול את הצינורות ultracentrifuge כדי לוודא שהם יהיו כולם מאוזנת תוך סיבוב בתוך ultracentrifuge. בצע את כל השינויים המשקל על ידי הוספת מאגר תמוגה ¹ עד השכבה העליונה.
6. לאחר צינורות נשקלנו, למקם אותם לסלים של הרוטור.
7. שמים את כל הדליים לתוך הרוטור SW28 בזהירות במקום הרוטור לתוך ultracentrifuge.
8. Ultracentrifuge דגימות RCF 107163.6 במשך 2.5 שעות ב 4 ° C.
9. לאחר צנטריפוגה תושלם, להסיר את supernatant, יחד עם שכבה של פסולת למצוא שיפוע הריכוז, עם השימוש בחלל ריק, תוך הקפדה לא להפריע גלולה המכילה את הגרעינים בתחתית הצינור.
10. הוספת 500 μL של 1X PBS לכל גלולה ולתת לשבת על קרח במשך 20 דקות. זה מאפשר גלולה כדי לפזר קצת על עצמו, מה שמקל מאוחר יותר מכנית לפזר אותו על ידי pipetting למעלה ולמטה, אשר מפחית את כמות הלחץ ניסיון גרעינים.
11. לאחר גרעינים יש מודגרות על קרח במשך 20 דקות, מכנית פיפטה מעלה ומטה כדי לפזר את הגרעינים לחלוטין בתוך 1XPBS.
12. הסר את הפתרון הגרעינים המכילים מן הצינורות ultracentrifuge לשלב את התוכן של שני צינורות לתוך צינור microcentrifuge יחיד 2 מ"ל. שוב, במקום על דגימות קרח.

Immunostaining עבור FACS

1. בשלב זה, לעשות immunostaining תערובת מורכבת של הנוגדן הראשוני והמשני, ועל חסימת מערבבים. עבור כל דגימה, לשלב 300 μL של 1XPBS המכיל 1.2 μL של נוגדן NeuN, 100 μL של חסימת מערבבים, אשר מכיל BSA 0.5% ו -10% סרום עיזים רגילה 1XPBS, ו 1 μL של אלקסה פלואוריד 488. עבור דגימות שליטה, להוציא את NeuN נוגדן ראשוני, ובמקום זאת, רק להוסיף 1XPBS יותר.
2. וורטקס את התערובת immunostaining ו דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
3. בעוד הוא מכתים את התערובת דוגרים, להפוך את הפקדים עבור הדגימות. עבור FACS מיון, מדגם, המכיל גרעינים בלבד, שנקרא "שליטה בלא כתם" נדרשת; מדגם השני, שליטה שלילית, המכיל את הגרעינים עם נוגדן המשני אלקסה פלואוריד 488 ללא NeuN נוגדן ראשוני יש צורך גם.
4. 20 Aliquot μL של גרעינים המכיל פתרון לתוך צינור microcentrifuge 2 מ"ל המכיל 1XPBS לשליטה בלא כתם, ועוד 20 μL לתוך צינור 2 נוסף המכיל 980 מ"ל של UL 1XPBS לבקרה שלילית. להעלות את עוצמת הקול של הגרעינים המכילים מדגם לגבות מ"ל 1 עם 1XPBS. כל הדגימות מוצבות שוב על הקרח.
5. עכשיו את התערובת immunostaining סיימה דוגרים, להוסיף את תוכנו של μL 401 לתוך דגימות המתאים. המדגם גרעינים יקבל את תערובת המכילה שני NeuN ו אלקסה פלואוריד 488, בעוד מדגם שלילי יקבל את תערובת המכילה רק את הנוגדן משני אלקסה פלואוריד 488.
6. קח את דגימות לחדר קר לסובב בחושך במשך 45 דקות.
7. לאחר הדגימות יש מודגרות בחושך במשך 45 דקות, לשים אותם על הקרח ולהביא אותם למתקן FACS. במהלך התחבורה למתקן FACS, הדגימות יש לשמור על קרח בחושך.

FACS

1. במתקן FACS, לסנן את הדגימות באמצעות מסנן 40 אממ. לאחר מכן, ולהפעיל אותם דרך המכשיר לכמה דקות, תוך שמר קר, כדי לקבל כמה נתונים ראשוניים לפני המיון.
2. בשלב זה, יש צורך להגדיר את השערים המתאימים הנדרשים למיון. שערים שונים משמשים מעין דגימות. השער הראשון נותן מושג על גודל הגרעינים השונים נמצא בתוך המדגם, ומאפשר separatation של פסולת גרעינים בפועל. השער השני מאפשר לנו למיין גרעינים בנפרד. בטל אגרגטים כל מבוטלים בשלב זה. לבסוף, השער השלישי מוגדר הקרינה באורך גל מסוים, תואם לזה של fluorochrome נמצאו נוגדנים משני שלנו. הצבת שער זה מאפשר לנו למיין + NeuN נפרד, ומכאן גרעינים העצבית מ NeuN - גרעינים.
3. אחרי כל השערים הם בחרו, הגרעינים ניתן למיין לתוך 1XPBS.
4. לאחרמדגם שלם עבר, לבדוק את טוהר הסוג על ידי הפעלת aliquot המדגם מיון דרך המכשיר. ודא כי הקרינה של מדגם לא פרוש, אלא נכלל בתוך רביע אחד. עדיף לבחור דגימות אשר מעל 90% טהור.

לאחר FACS

1. לאחר המדגם כבר מיון, עיבוד של הגרעינים יכולה להתחיל. קח 10 מ"ל של המדגם מיון ולהוסיף לו 2 מ"ל של פתרון סוכרוז ^2, 50 UL של 1M CaCl ₂ ו - ul של 1m 30 מ"ג (אייס) _2. כתזכורת, תמיד הקפד לשמור את הדגימה על הקרח מאז הגרעינים הם מבולבל.
2. אם יש פחות מ 10 מ"ל של המדגם מיון, להעלות את נפח של עד 10 מ"ל ידי הוספת 1XPBS, או להתאים את חומרים נוספים בהתאם.
3. ללא מרחב המדגם מספר פעמים ומניחים על קרח במשך 15 דקות.
4. לאחר הדגימות יש מודגרות על קרח במשך 15 דקות, צנטריפוגה אותם הרוטור דלי הנדנדה ב RCF 1786 למשך 15 דקות 4 ^° C.
5. בטל supernatant עם השימוש בחלל ריק, מבלי להפריע לבן גלולה נמצא בחלק התחתון של הצינור.
6. ממיסים את גלולה ב 200 μl של מה הפתרון שאתה צריך עבור הניסויים בהליך, ועל פיפטה למעלה ולמטה.
7. מעבירים את הפתרון לתוך צינור קטנים ומניחים אותו בתוך המקפיא -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

Discussion

הפרוטוקול המובא כאן צריך להיות שימושי במיוחד עבור מחקרים התמקדו בשינויים epigenetic של הכרומטין העצבית, ובאופן כללי יותר, על הפנוטיפ המולקולרי של גרעין עצבי, במהלך מחלה נוירולוגית או פסיכיאטרית נורמלי בפיתוח הזדקנות, או. השיטה היא יתרון מסוים כאשר ההטרוגניות הסלולר של רקמת המוח, כולל משמרות פוטנציאליים מנת נוירון אל גליה במהלך ההזדקנות או עקב מחלה הם דאגה ^1. לדוגמה, על ידי שילוב של פרוטוקול מיון הנוכחי עם טכניקות הכרומטין immunoprecipitation, אנו לאחרונה תיאר נוירון ספציפי תבניות מתילציה היסטון על המוח נגזר גורם neurotrophic (BDNF) מקדם הגן, ועל גנים עצבי נוסף ^2. שיטה דומה היתה השתמשו בעבר כדי לאסוף את הנוירונים מפני קליפת המוח המבוגר ללידה רטרוספקטיבי היכרויות ^3. הטכניקה מיון הועסק גם עכבר המוח ^2, ובגלל היציבות של גרעיני ב קפוא אז להפשיר רקמות, אנו צופים כי הגישה המוצגת כאן הוא ישים למגוון רחב של מינים. מכיוון immunoprecipitation הכרומטין מ קטנה כמו 10,000 תאים כעת אפשרי גם עבור כיסוי מקיף יותר הגנום ^4, יתכן שניתן יהיה להשתמש הרבה פחות מאשר 1,000 מ"ג של חומר המוצא שאנחנו מומלץ לעיל.

Materials

Reagents: 1. Lysis Buffer 0.32M Sucrose 5.47 g 5 mM CaCl2 250 μl 3 mM Mg(Acetate)2 150 μl 0.1 mM EDTA 10 μl 10mM Tris-HCl, pH8 500 μl 1 mM DTT 17 μl 0.1% Triton X-100 50 μl Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water 2. Sucrose Solution 1.8 M Sucrose 30.78 g 3 mM Mg(Acetate)2 150 μl 1 mM DTT 17 μl 10 mM Tris-HCl, pH8 500 μl Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water 3. Dounce buffer 10 mM Tris 0.242 g 4 mM MgCl2 0.163 g 1 mM CaCl2 0.03 g Adjust pH to 7.5 and volume to 200 ml with Autoclaved water