عزل النواة من الخلايا العصبية البشرية تشريح أنسجة المخ

Summary

عدم تجانس الخلوي للأنسجة المخ يشكل قيدا هاما لدراسة علامات جينية في لونين لأن معظم فحوصات نقص واحد قرار الخلية. الخلايا العصبية عادة ما تختلط مع الخلايا الدبقية وغيرها من المنظمات غير العصبية. ونحن نقدم على بروتوكول لاستخراج وجمع النوى من الخلايا العصبية في الدماغ البشري.

Abstract

الخلايا العصبية في الدماغ البشري تصبح تالية للتفتل بشكل كبير خلال التنمية قبل الولادة ، وبالتالي الحفاظ على النواة طوال العمر الكامل. ومع ذلك ، لا يعرف إلا القليل عن تغييرات في الخلايا العصبية وتنظيم الكروماتين النووي خلال مسيرة التنمية والشيخوخة ، أو في أمراض العصبية المزمنة. ومع ذلك ، حتى الآن فحوصات على الحمض النووي ، ومعظم لونين (عدا الأسماك) قرار عدم خلية واحدة. تحقيقا لهذه الغاية ، وعدم تجانس كبير الخلوي للأنسجة المخ يشكل قيدا كبيرا ، لأن تختلط الشرائح السكانية المختلفة عادة من الخلايا العصبية مع أنواع مختلفة من الخلايا الدبقية وغيرها من المنظمات غير العصبية. وأحد الحلول الممكنة لنمو الخلية من نوع ثقافات محددة ، ولكن معظم خلايا الجهاز العصبي المركزي ، بما في ذلك الخلايا العصبية ، هي فيفو السابقين المستدامة ، في أحسن الأحوال ، لمدة أسابيع قليلة فقط ، وبالتالي سيوفر نموذجا غير مكتمل للآليات العاملة جينية محتملة عبر عمر كامل . هنا ، ونحن نقدم على بروتوكول لاستخراج وتنقية النوى من المجمدة (أبدا الثابتة) في الدماغ بعد الوفاة الإنسان. الأسلوب ينطوي على استخراج النواة في المخزن تحلل ناقص التوتر ، تليها تنبيذ فائق وimmunotagging المضادة للNeuN الأضداد. ثم يتم جمع نوى الخلايا العصبية المسماة بشكل منفصل باستخدام مضان تنشيط الفرز. وينبغي أن تكون هذه الطريقة تنطبق على أي منطقة في الدماغ في مجموعة واسعة من الأنواع ومناسب للدراسات مناعي لونين مع الموقع وتعديلها محددة أضداد هيستون ، وفحوصات الحامض النووي وغيرها.

Protocol

استخراج النوى

1. طرح 250 ملغ من أنسجة المخ بعد الوفاة المجمدة في 5 مخزن تحلل مل ¹ في douncer ووضعه على الجليد. لاستقبال نحو 5 ملايين النوى بعد FACS الفرز ، ونحن عادة استخدام أنسجة من 1000 ملغ في كل عينة.
2. مرة واحدة وإذابة الأنسجة ، dounce النسيج لمدة 1 دقيقة في حين على الجليد.
3. أخذ نسيج متجانس ووضعه في أنبوب 15 مل نابذة فائقة السرعة واضحة. وضع أنبوب على الجليد.
4. تأخذ 9 مل من محلول السكروز ² مع ماصة ، ماصة وضع في أسفل الأنبوب نابذة فائقة السرعة واضحة ، والافراج عن حلول السكروز ² إلى إنشاء معامل تركيز مع الحل النسيج المتجانس على رأس الحل السكروز ^2.
5. وزن الأنابيب نابذة فائقة السرعة للتأكد من أن كل ما سوف يكون متوازنا في حين تناوب داخل نابذة فائقة السرعة. إجراء أية تعديلات على الوزن عن طريق إضافة ¹ إلى الاحتياطي تحلل الطبقة العليا.
6. بعد أن تم وزن الأنابيب ووضعها في دلاء الدوار.
7. إخضاع جميع الدلاء في الدوار SW28 ومكان بعناية الدوار في نابذة فائقة السرعة.
8. نابذة فائقة السرعة العينات في إطار التعاون الإقليمي ل107163.6 2.5 ساعة في 4 درجات مئوية.
9. بمجرد اكتمال الطرد المركزي ، وإزالة طاف ، جنبا إلى جنب مع طبقة من الأنقاض التي عثر عليها في التدرج التركيز ، مع استخدام فراغ ، مع الحرص على عدم تعكير صفو بيليه الذي يحتوي على نواة في الجزء السفلي من الأنبوب.
10. إضافة 500 ميكروليتر من PBS 1X إلى كل بيليه وترك الجلوس على الثلج لمدة 20 دقيقة. هذا يسمح بحل بيليه قليلا من تلقاء نفسها ، مما يسهل لاحقا من قبل بحل ميكانيكيا pipetting صعودا وهبوطا ، مما يقلل من مقدار الضغط تجربة النوى.
11. بعد النوى وحضنت على الجليد لمدة 20 دقيقة ، ماصة ميكانيكيا صعودا وهبوطا في حل تماما النوى داخل 1XPBS.
12. إزالة حل النوى التي تحتوي على أنابيب من نابذة فائقة السرعة ، والجمع بين محتويات أنبوبين في واحد 2 مل أنبوب microcentrifuge. مرة أخرى ، ووضع العينات في الثلج.

Immunostaining لFACS

1. عند هذه النقطة ، وجعل مزيج يتألف من جسم immunostaining الابتدائي والثانوي ، وحجب ميكس. لكل عينة ، والجمع بين 300 ميكرولتر من 1XPBS تحتوي على 1.2 ميكرولتر من الأجسام المضادة NeuN ، 100 ميكرولتر من مزيج الحظر ، الذي يحتوي على 0.5 ٪ BSA و 10 ٪ في مصل الماعز 1XPBS عادي ، و 1 ميكرولتر من فلور اليكسا 488. لعينات السيطرة ، استبعاد NeuN الضد الابتدائي ، وبدلا من ذلك ، فقط إضافة المزيد من 1XPBS.
2. دوامة الخليط immunostaining واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
3. في حين أن الخليط هو تلطيخ يحتضنها ، وجعل ضوابط لهذه العينات. FACS لفرز عينة ، تحتوي على نواة وحدها ، ودعا هناك حاجة إلى "السيطرة غير ملوثين" ؛ عينة الثانية ، سيطرة السلبية ، التي تحتوي على نوى مع فلور الضد اليكسا دون الثانوية 488 وهناك حاجة أيضا إلى الأجسام المضادة NeuN الابتدائي.
4. قسامة 20 ميكرولتر من نواة تحتوي على الحل في أنبوب microcentrifuge 2 مل تحتوي على 1XPBS لمراقبة غير ملوثين ، وآخر في آخر 20 ميكرولتر أنبوب 2 مل تحتوي على 980 UL من 1XPBS لمراقبة سلبية. رفع حجم النواة المحتوية على عينة ما يصل الى 1 مل مع 1XPBS. وضعت جميع العينات مرة أخرى على الجليد.
5. الآن بعد أن انتهت خليط immunostaining يحتضنها ، إضافة محتوياته من 401 ميكرولتر في العينات المناسبة. وسوف تتلقى نوى العينة تحتوي على خليط كلا NeuN واليكسا فلور 488 ، في حين أن العينة سلبية سوف تحصل على خليط يحتوي فقط على الأجسام المضادة الثانوية اليكسا فلور 488.
6. أخذ العينات في غرفة باردة لتدوير في الظلام لمدة 45 دقيقة.
7. بعد هذه العينات والمحتضنة في الظلام لمدة 45 دقيقة ، ووضعها على الجليد وتقديمهم إلى مرفق نظام مراقبة الأصول الميدانية. أثناء النقل إلى مرفق نظام مراقبة الأصول الميدانية ، ينبغي أن تبقى هذه العينات في الثلج والظلام.

FACS

1. في منشأة FACS تصفية العينات من خلال تصفية 40 ميكرون. ثم تشغيلها من خلال أداة لبضع دقائق ، في حين يتم الاحتفاظ الباردة ، من أجل الحصول على بعض البيانات الأولية قبل الفرز.
2. عند هذه النقطة ، فمن الضروري تعيين البوابات الملائمة اللازمة للفرز. وتستخدم بوابات متعددة ومختلفة لعينات الفرز. البوابة الأولى يعطي فكرة عن حجم نواة المختلفة الموجودة داخل العينة ، ويسمح separatation الحطام من نوى الفعلية. البوابة الثانية يسمح لنا لفرز نواة على حدة. يتم تجاهل أي تجاهل المجاميع عند هذه النقطة. أخيرا ، يتم تعيين البوابة الثالثة لطول الموجة ومضان محددة ، مطابقة لتلك الموجودة في جسم ملون تألقي دينا الثانوي. وضع يسمح لنا هذه البوابة لفرز وفصل + NeuN ، وبالتالي نواة الخلايا العصبية من NeuN -- النوى.
3. بعد يتم اختيار جميع البوابات ، يمكن فرز النوى في 1XPBS.
4. مرة واحدةعينة كاملة قد مرت ، والتحقق من نقاء من النوع عن طريق تشغيل قسامة من العينة فرزها من خلال الصك. تأكد من أن لا ينتشر مضان العينة للخروج ، وإنما يرد ضمن رباعي واحد. فمن الأفضل لاختيار العينات التي تزيد على 90 ٪ نقية.

بعد FACS

1. مرة واحدة وقد تم فرز عينة ، وتجهيز نواة يمكن أن تبدأ. يستغرق 10 مل من العينة فرز وإضافة إلى ذلك 2 مل من محلول السكروز ² ، 50 ماي من 1M CaCl ₂ و 30 من المجاهدين ميغاغرام 1M (ايس) _2. للتذكير ، أن تكون دائما على يقين من أن تبقي على عينة الجليد منذ النوى وغير المثبتة.
2. إذا كان هناك أقل من 10 مل من عينة تم فرزها ، ورفع حجم ما يصل الى 10 مل بإضافة 1XPBS ، أو ضبط مواد إضافية وفقا لذلك.
3. عكس العينة عدة مرات ومكان على الجليد لمدة 15 دقيقة.
4. بعد هذه العينات قد حضنت على الجليد لمدة 15 دقائق ، طرد مركزي لهم في الأرجوحة الدوارة في دلو RCF 1786 لمدة 15 دقيقة على ⁴ درجات مئوية.
5. تجاهل طاف مع استخدام فراغ ، ودون الإخلال بيليه الأبيض التي عثر عليها في الجزء السفلي من الأنبوب.
6. حل بيليه في 200 ميكرولتر أيا كان الحل الذي تحتاجه لإجراء التجارب ، وماصة صعودا وهبوطا.
7. نقل الى حل أصغر أنبوب وضعه في الثلاجة حتى -80 درجة مئوية استخدامها مرة أخرى.

Discussion

بروتوكول المقدمة هنا ينبغي أن تكون مفيدة بشكل خاص للدراسات التي تركز على التغيرات اللا جينية للونين العصبية ، وبشكل أعم ، على النمط الظاهري الجزيئي لنواة الخلايا العصبية ، أثناء المرض والشيخوخة النامية ، أو في الحالات العادية عصبية أو نفسية. الأسلوب هو من ميزة خاصة عند عدم تجانس الخلوي للأنسجة المخ ، بما في ذلك التحولات المحتملة في الخلايا العصبية إلى الدبقية التموينية خلال الشيخوخة أو بسبب المرض هي مصدر قلق ^1. على سبيل المثال ، من خلال الجمع بين بروتوكول الفرز الحالية مع التقنيات مناعي لونين ، ونحن في الآونة الأخيرة وصف الخلايا العصبية الخاصة أنماط مثلأيشن هيستون في الدماغ المستمدة عصبية المروج عامل الجينات (BDNF) ، و ² للجينات الخلايا العصبية الإضافية. وقد استخدمت طريقة مشابهة في السابق لجمع الخلايا العصبية من قشرة الدماغ الكبار للولادة تعود بأثر رجعي ^3. كان يعمل أيضا على تقنية الفرز في مخ الفأر ² ، ونظرا للاستقرار في نوى مجمدة آنذاك المذوبة. الأنسجة ، ونتوقع أن النهج المعروضة هنا ينطبق على طائفة واسعة من الأنواع لأن مناعي لونين من اقل من 10000 لخلايا غير مجدية حتى الآن عن تغطية أكثر شمولا الجينوم ⁴ ، فإنه قد يكون من الممكن استخدام كميات أقل بكثير من 1000 ملغ من المواد ابتداء أننا الموصى به أعلاه.

Materials

Reagents: 1. Lysis Buffer 0.32M Sucrose 5.47 g 5 mM CaCl2 250 μl 3 mM Mg(Acetate)2 150 μl 0.1 mM EDTA 10 μl 10mM Tris-HCl, pH8 500 μl 1 mM DTT 17 μl 0.1% Triton X-100 50 μl Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water 2. Sucrose Solution 1.8 M Sucrose 30.78 g 3 mM Mg(Acetate)2 150 μl 1 mM DTT 17 μl 10 mM Tris-HCl, pH8 500 μl Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water 3. Dounce buffer 10 mM Tris 0.242 g 4 mM MgCl2 0.163 g 1 mM CaCl2 0.03 g Adjust pH to 7.5 and volume to 200 ml with Autoclaved water