Neuronale Kerne Isolation von Human Postmortem Gehirngewebe

Summary

Die zellulären Heterogenität von Hirngewebe stellt eine erhebliche Einschränkung für das Studium der epigenetischen Markierungen in Chromatin, da die meisten Assays einzelne Zelle Auflösung fehlt. Neuronen sind typischerweise mit Glia und andere nicht-neuronalen Zellen vermischt. Wir bieten ein Protokoll zu extrahieren und zu sammeln neuronale Kerne von menschlichen Gehirns.

Abstract

Neuronen im menschlichen Gehirn postmitotischen weitgehend geworden während der pränatalen Entwicklung, und behalten so ihre Kerne während der gesamten Lebensdauer. Es ist jedoch wenig über die Änderungen in der neuronalen Chromatin und nukleare Organisation im Laufe der Entwicklung und Alterung, oder bei chronischen neuropsychiatrischen Krankheit bekannt. Doch bis heute die meisten Chromatin und DNA basierenden Tests (außer Fisch) fehlen einzelne Zelle Auflösung. Zu diesem Zweck stellt die erheblichen zellulären Heterogenität des Hirngewebes eine erhebliche Einschränkung, denn in der Regel verschiedene Subpopulationen von Neuronen mit verschiedenen Arten von Gliazellen und anderen nicht-neuronalen Zellen vermischt. Eine mögliche Lösung wäre, Zelltyp-spezifische Kulturen wachsen, aber die meisten ZNS-Zellen, einschließlich Neuronen, sind ex vivo eine nachhaltige, am besten, denn nur ein paar Wochen und somit würde ein unvollständiges Modell für epigenetische Mechanismen potentiell Betriebskosten über die gesamte Lebensdauer liefern . Hier bieten wir ein Protokoll zu extrahieren und zu reinigen Kerne aus gefrorenem (nie fest) menschlichen post mortem Gehirn. Das Verfahren beinhaltet die Extraktion der Kerne in hypotone Lyse-Puffer, durch Ultrazentrifugation und immunotagging mit anti-NeuN-Antikörper. Labeled neuronale Kerne werden dann separat mit Fluoreszenz-aktivierter Sortierung gesammelt. Diese Methode sollte für jede Region des Gehirns in eine Vielzahl von Arten und für Chromatinimmunpräzipitation Studien mit Ort-und Umbau-spezifischen anti-Histon-Antikörper, und für die DNA-Methylierung und andere Assays.

Protocol

Kerne Extraction

1. Legen Sie 250 mg des gefrorenen postmortem Gehirngewebe in 5 ml Lysepuffer ¹ in einem douncer und legen Sie sie auf Eis. So empfangen Sie ca. 5 Millionen Keime nach FACS-Sortierung verwenden wir im allgemeinen 1000 mg Gewebe pro Probe.
2. Sobald das Gewebe aufgetaut, Dounce das Gewebe für 1 Minute, während auf dem Eis.
3. Nehmen Sie die homogenisierte Gewebe und legen Sie sie in eine 15 ml klare Ultrazentrifuge Röhre. Setzen Sie das Rohr auf dem Eis.
4. Nehmen 9 ml Saccharose-Lösung ² mit einer Pipette, legen Sie die Pipette an der Unterseite des klaren Ultrazentrifuge Rohr, und lassen Sie die Saccharose-Lösung ² zu einem Konzentrationsgradienten mit dem homogenisierten Gewebe Lösung auf der Oberseite des Saccharose-Lösung ^{2 zu} erstellen.
5. Wiegen der Ultrazentrifuge Röhren, um sicherzustellen, dass sie alle werden ausgeglichen, während sich drehenden innerhalb der Ultrazentrifuge werden. Nehmen Sie die Anpassungen, um das Gewicht, indem Lysispuffer ^1, um die oberste Schicht.
6. Nach dem Röhrchen gewogen wurden, legen Sie sie in den Rotor der Eimer.
7. Legen Sie alle Eimer in einen SW28 Rotor und setzt vorsichtig den Rotor in der Ultrazentrifuge.
8. Ultrazentrifuge der Proben bei 107163,6 RCF 2,5 Stunden bei 4 ° C.
9. Nach der Zentrifugation abgeschlossen ist, entfernen Sie den Überstand, zusammen mit der Schicht aus Schutt an der Konzentrationsgradient gefunden, mit dem Einsatz von Vakuum, während man aufpassen, nicht das Pellet enthält die Kerne am Boden des Röhrchens zu stören.
10. Add 500 mL 1X PBS in jedes Pellet und lassen Sie sich auf dem Eis für 20 Minuten. Dies ermöglicht das Pellet ein wenig auf seine eigene Auflösung, so dass es später leichter mechanisch löse es durch Auf-und Abpipettieren, die verringert die Menge der Stress der Kerne zu erleben.
11. Nach der Kerne auf Eis für 20 Minuten haben inkubiert, mechanisch Pipette auf und ab um sich vollständig aufzulösen die Kerne innerhalb 1XPBS.
12. Entfernen Sie die Kerne-haltigen Lösung aus der Ultrazentrifuge Rohre und kombinieren Sie die Inhalte von zwei Rohren in einem einzigen 2 mL Reaktionsgefäß. Auch hier legen Sie die Proben auf Eis.

Immunfärbung für FACS

1. An dieser Stelle, machen Sie eine Immunfärbung Mischung aus primären und sekundären Antikörpers zusammengesetzt und Blocking Mix. Für jede Probe kombinieren 300 ul 1XPBS mit 1,2 ul der NeuN Antikörper, 100 L Blocking Mix, die 0,5% BSA und 10% normales Ziegenserum in 1XPBS und 1 ul Alexa Fluor 488 enthält. Für den Kontrollproben, schließen Sie die primäre Antikörper NeuN und statt dessen einfach mehr 1XPBS.
2. Vortex die Immunfärbung Mischung und Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln.
3. Während die Färbung Mischung inkubiert, um die Steuerelemente für die Proben. Für FACS-Sortierung, eine Probe, die Kerne allein, die so genannte "ungefärbte Kontrolle" notwendig ist, eine zweite Probe, eine negative Kontrolle, welche die Kerne mit dem sekundären Antikörper Alexa Fluor 488, ohne den primären Antikörper NeuN auch benötigt wird.
4. Aliquot 20 ul der Kerne enthaltenden Lösung in einem 2 ml Reaktionsgefäß mit 1XPBS für die ungefärbten Kontrolle, und weitere 20 ul in eine andere 2 ml Tube mit 980 uL der 1XPBS für die negative Kontrolle. Erhöhen Sie die Lautstärke der Kerne enthaltenden Probe wieder auf 1 ml mit 1XPBS. Alle Proben sind wieder auf Eis gelegt.
5. Nun, da die Immunfärbung Mischung fertig Inkubation, fügen Sie den Inhalt von 401 ul in die entsprechenden Proben. Die Kerne Probe erhalten die Mischung, die sowohl NeuN und Alexa Fluor 488, während die negative Probe der Mischung, die nur den sekundären Antikörper Alexa Fluor 488 erhalten.
6. Nehmen Sie die Proben in den kalten Raum im Dunkeln für 45 Minuten zu drehen.
7. Nachdem die Proben im Dunkeln für 45 Minuten inkubiert wurden, legte sie auf Eis und bringt sie zu den FACS-Anlage. Während des Transports in der FACS-Anlage, sollten die Proben auf Eis und im Dunkeln gehalten werden.

FACS

1. Bei der FACS-Anlage, filtern Sie die Proben durch einen 40 um Filter. Dann führen sie durch das Instrument für ein paar Minuten, während sie kalt gehalten, um einige vorläufige Daten vor dem Sortieren zu bekommen.
2. An dieser Stelle ist es notwendig, die entsprechenden Tore für die Sortierung gesetzt werden müssen. Mehrere verschiedene Tore sind zu sortieren Proben verwendet. Das erste Tor gibt eine Vorstellung von der Größe der verschiedenen Kerne in der Probe gefunden, und ermöglicht separatation von Schutt von den tatsächlichen Kernen. Das zweite Tor ermöglicht es uns, Kerne einzeln zu sortieren. Entsorgen Sie alle Aggregate sind an dieser Stelle verworfen. Schließlich ist das dritte Tor zu einer bestimmten Fluoreszenzwellenlänge gesetzt, passend, dass der Fluorochrom in unserem sekundären Antikörper gefunden. Platzieren dieses Tor ermöglicht es uns, zu sortieren und trennen NeuN +, also neuronale Kerne aus NeuN - Kernen.
3. Nach all den Toren gewählt sind, können die Kerne in 1XPBS sortiert werden.
4. Sobald dergesamte Probe durchlaufen hat, überprüfen Sie die Reinheit der Art, indem Sie einen aliquoten Teil der Probe sortiert durch das Instrument. Stellen Sie sicher, dass die Probe die Fluoreszenz nicht ausgebreitet, sondern in einem einzigen Quadranten enthalten. Am besten ist es Proben, die mehr als 90% rein sind zu wählen.

Nach FACS

1. Sobald die Probe wurde sortiert, kann beginnen Verarbeitung der Kerne. Nehmen Sie sich 10 mL Probe sortiert und fügen Sie 2 ml Saccharose-Lösung ^2, 50 ul 1 M CaCl ₂ und 30 ul von 1m Mg (Ace) _2. Zur Erinnerung: immer sicher sein, um die Probe auf Eis zu halten, da die Kerne unfixierten sind.
2. Wenn es weniger als 10 ml sortiert Probe, die Lautstärke zu erhöhen bis zu 10 mL, indem 1XPBS, oder stellen Sie die zusätzlichen Materialien entsprechend.
3. Kehren Sie die Probe mehrmals und auf Eis für 15 Minuten.
4. Nachdem die Proben auf Eis für 15 Minuten inkubiert, zentrifugiert sie in einer Schaukel Eimer Rotor bei 1786 RCF für 15 Minuten bei ⁴ ° C.
5. Verwerfen Sie den Überstand mit dem Einsatz von Vakuum, ohne die weiße Pellet am Boden des Röhrchens gefunden.
6. Lösen Sie das Pellet in 200 ul, was für Sie optimalen Lösung für das Verfahren Experimente und Pipette auf und ab.
7. Übertragen Sie die Lösung in ein kleineres Rohr und legen Sie sie in die -80 ° C Gefrierschrank bis zur weiteren Verwendung.

Discussion

Das Protokoll hier vorgestellten sollte besonders nützlich für Studien zu epigenetischen Veränderungen der neuronalen Chromatin und ganz allgemein ausgerichtet, auf der molekularen Phänotyp der neuronalen Zellkern, während der normalen Entwicklung und Alterung, oder in neurologischen oder psychiatrischen Erkrankungen. Die Methode ist von besonderem Vorteil, wenn die zelluläre Heterogenität des Hirngewebes, einschließlich der möglichen Verschiebungen in Neuron-to-Glia Ration im Verlauf des Alterns oder wegen Krankheit eine Sorge ¹ sind. Zum Beispiel durch die Kombination der gegenwärtigen Sortier-Protokoll mit Chromatinimmunpräzipitation Techniken haben wir vor kurzem beschrieben Neuronen-spezifische Histon-Methylierungsmuster im Gehirn neurotrophen Faktor (BDNF) Gen-Promotor, und für zusätzliche neuronale Gene ^2. Eine ähnliche Methode wurde zuvor zu Neuronen aus adulten Großhirnrinde für die retrospektive Geburt datiert ^3. Sammeln verwendet. Die Sortierung Technik wurde auch in Maus-Gehirn ² eingesetzt, und wegen der Stabilität von Atomkernen in frozen-dann-wieder aufgetaut Gewebe, erwarten wir, dass der hier vorgestellte Ansatz für eine breite Palette von Arten ist. Da Chromatinimmunpräzipitation schon ab 10.000 Zellen für ist nun möglich, auch für eine umfassendere Genomabdeckung ⁴ kann es möglich sein, viel weniger als die 1000 mg des Ausgangsmaterials, dass wir oben empfohlen werden.

Materials

Reagents: 1. Lysis Buffer 0.32M Sucrose 5.47 g 5 mM CaCl2 250 μl 3 mM Mg(Acetate)2 150 μl 0.1 mM EDTA 10 μl 10mM Tris-HCl, pH8 500 μl 1 mM DTT 17 μl 0.1% Triton X-100 50 μl Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water 2. Sucrose Solution 1.8 M Sucrose 30.78 g 3 mM Mg(Acetate)2 150 μl 1 mM DTT 17 μl 10 mM Tris-HCl, pH8 500 μl Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water 3. Dounce buffer 10 mM Tris 0.242 g 4 mM MgCl2 0.163 g 1 mM CaCl2 0.03 g Adjust pH to 7.5 and volume to 200 ml with Autoclaved water