Summary
यह एक परिचय Xenopus laevis oocytes से दबाना रिकॉर्डिंग पैच के रूप में इरादा है. यह vitelline झिल्ली हटाने, gigaohm मुहर (gigaseal) के गठन और बाहर - बाहर टोपोलॉजी करने के लिए पैच के वैकल्पिक रूपांतरण शामिल हैं.
Abstract
Sakmann और 1 Neher, 2 द्वारा अपने विकास के बाद से, पैच दबाना एकल या एकाधिक कक्षों में आयन चैनलों के electrophysiological माप के लिए एक अत्यंत उपयोगी तकनीक के रूप में स्थापित हो गया है. दोनों उनके पैतृक वातावरण में आयन चैनलों के लिए इस तकनीक को लागू किया जा सकता है और जैसे अफ्रीकी clawed मेंढक, Xenopus laevis से काटा oocytes heterologous कोशिकाओं में व्यक्त की. यहाँ, हम पैच Xenopus oocytes से दबाना रिकॉर्डिंग की अच्छी तरह से स्थापित तकनीक का वर्णन. इस तकनीक को व्यक्त आयन चैनल के गुणों (macropatch) आबादी या व्यक्तिगत (एकल चैनल रिकॉर्डिंग) में या तो उपाय करने के लिए प्रयोग किया जाता है. हम तकनीक पर ध्यान केंद्रित करने के लिए oocyte की तैयारी और मुहर पीढ़ी की गुणवत्ता को अधिकतम. सभी कारकों के साथ अनुकूलित किया है, इस तकनीक का 90 प्रतिशत से अधिक सफल मुहर पीढ़ी के एक प्रायिकता देता है. प्रक्रिया हर कारकों वह या वह सबसे महत्वपूर्ण पाता के आधार पर शोधकर्ता द्वारा अलग अनुकूलित कर सकते हैं, और हम दृष्टिकोण है कि हमारे हाथ में सबसे बड़ी सफलता के लिए नेतृत्व है मौजूद है.
Protocol
भाग 1: vitelline झिल्ली हटाना
- संदंश के दो सेट तैयार. हम नहीं 5 संदंश, जहां एक सेट थोड़ा किया गया है एक फ़ाइल के साथ तेज पसंद करते हैं. इसके अलावा trimming और आग चमकाने एक 7 "पाश्चर पिपेट एक गिलास हस्तांतरण विंदुक तैयार करते हैं.
- अनुशंसित: फिसल से oocytes को रोकने के लिए, ग्रिड का एक चक्र (1 मिमी वर्ग) में कटौती और एक 60mm पेट्री डिश के तल में गोंद. इस डिश को अनिश्चित काल के reused किया जा सकता है अगर साफ उपयोग करता है के बीच रखा.
- पेट्री डिश आधे रास्ते hyperosmotic (नुस्खा देखें) एक विदारक खुर्दबीन के नीचे और समाधान जगह के साथ भरें.
- उनके एक पॉलिश पाश्चर और पकवान में पिपेट जगह के साथ ऊष्मायन समाधान से 1-3 Xenopus oocytes निकालें.
- 15s रुको - कोशिकाओं के लिए 2 मिनट के लिए हटना करने के लिए शुरू. अब समय छील करने के लिए कक्षों को आसान बनाने, कम समय पट्टी के लिए स्वस्थ कोशिकाओं के लिए नेतृत्व.
- सेल सिकुड़ती के रूप में, vitelline झिल्ली बमुश्किल सेल पर एक पारदर्शी परत के रूप में दिखाई बनने के लिए शुरू हो जाएगा. छीलने के लिए एक स्वस्थ कोशिका whorls (या दोष के बिना) का चयन करें.
- संदंश की एक जोड़ी के साथ, धीरे प्लाज्मा झिल्ली को नुकसान पहुँचाए बिना vitelline झिल्ली समझ. दूसरे के साथ, एक ही स्थान के पास समझ और धीरे स्पष्ट झिल्ली फाड़ और सेल से मुक्त है.
- पाश्चर विंदुक के साथ, ध्यान से रिकॉर्डिंग कक्ष के लिए कक्ष ले जाएँ. ध्यान दें कि सेल vitelline हटाने के बाद कमजोर हो जाएगा.
भाग 2: Gigaseal पीढ़ी
- नमक के साथ एक रिकॉर्डिंग विंदुक भरें. समाधान है कि बिजली तार के साथ अच्छा विद्युत संपर्क करता क्रम में विंदुक समाई कम से कम की न्यूनतम मात्रा का प्रयोग करें.
- विंदुक कई बार झाड़ बुलबुले नाव और बिजली तार पर स्लाइड की अनुमति है.
भरा विंदुक के लिए दबाव लागू करें. यह मुँह से या एक पालतू जानवर की दुकान से एक मछलीघर पंप के साथ किया जा सकता है है. इस दबाव रखने के विंदुक साफ के रूप में यह तरल इंटरफेस और सेल करने के लिए कदम को पार करने के लिए महत्वपूर्ण है. - चैम्बर में oocyte ढूँढें और सेल के किनारे पर तेजी से ध्यान केंद्रित.
- स्नान, बीच सेल ऊपर टिप (ध्यान के बाहर) के बाहर विंदुक के साथ. इस minimizes मुहर पीढ़ी से पहले स्नान में समय बिताया.
- विंदुक तेज सेल करने के लिए अगले ध्यान केंद्रित में नीचे गिरा. यह करीब निकटता (~ 50 माइक्रोन) में लाओ. तुम देखना चाहिए कि समाधान का एक छोटा सा विरूपण विंदुक वापस दबाव से बाहर धक्का दे दिया.
- पैच दबाना सॉफ्टवेयर का प्रयोग, विंदुक के प्रतिरोध की जांच (हमारे लक्ष्य लगभग 3-4 MΩ है) और मौजूदा ऑफसेट वोल्टेज का उपयोग कर शून्य.
- विंदुक पर सकारात्मक दबाव के साथ, टिप धीरे सेल की ओर, जबकि प्रतिरोध नेत्रहीन निगरानी या एक ऑडियो निगरानी है कि एक टोन आवृत्ति जिसका प्रतिरोध करने के लिए आनुपातिक है उत्पन्न का उपयोग कर ले जाने के. के रूप में टिप करने के लिए सेल स्पर्श करने के लिए शुरू होता है, प्रतिरोध में वृद्धि होगी.
- अचानक लेकिन धीरे लगभग एक ही निरपेक्ष मूल्य के सकारात्मक से नकारात्मक दबाव स्विच. प्रतिरोध गठन सील में वृद्धि करनी चाहिए.
- समय के बहुमत, कई सेकंड के भीतर सील गठन होता है, कभी कभी 30-60 सेकंड के लिए आवश्यक हैं.
- एक बार प्रतिरोध 1GΩ है, दबाव तटस्थ करने के लिए जारी किया जा सकता है. अब आप एक पैच पर सेल है. एक पैच अंदर - बाहर के लिए तेजी से सेल से दूर खींच. बाहर बाहर के लिए, नीचे देखें.
भाग 5: बाहर - बाहर टोपोलॉजी (वैकल्पिक)
- तुरंत एक gigaseal, टूटना झिल्ली को प्राप्त करने के बाद. यह तेज चूषण के साथ किया जा सकता है, लेकिन हम 1 एमएस के लिए एक 1 वी नाड़ी पसंद करते हैं. प्रारंभिक विंदुक प्रतिरोध की तुलना में थोड़ा अधिक प्रतिरोध छोड़ देना चाहिए.
- विंदुक सेल से धीरे से और आसानी दूर ले जाएँ. आप विंदुक के साथ सेल पुल के एक अनुभाग देखना चाहिए. अचानक, और कुछ ही सेकंड के भीतर, सेल वापस तस्वीर और प्रतिरोध GΩs तुरंत और साथ ही लौट जाना चाहिए.
- अब आप बाहर - बाहर विन्यास में एक पैच है. किसी भी शामिल आयन चैनल के ectodomains स्नान करने के लिए अवगत कराया है.
भाग 6: प्रत्याशित परिणाम
आम तौर पर, उच्च प्रतिरोध जवानों बेहतर और अब रहते हैं. 10 GΩ उच्च गुणवत्ता वाले जवानों के लिए एक अच्छा दिशानिर्देश है. हमारे अनुभव में, इस गुणवत्ता के जवानों होने की संभावना कई कारकों, विशेष रूप से सेल और विंदुक गुणवत्ता के साथ बदलती हैं. पैच अधिग्रहण दर 95% से अधिक स्वस्थ कोशिकाओं, साफ pipettes, और एक अनुभवी शोधकर्ता के साथ किया जा सकता है. इन पैच पिछले कई मिनट के लिए और आयन Xenopus oocytes में व्यक्त एकल चैनल रिकॉर्डिंग सहित चैनलों के किसी भी electrophysiological अध्ययन के लिए उपयुक्त हो सकता है.
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Discussion
Electrophysiological रिकॉर्डिंग के कई मापदंडों चर्चा यहाँ नहीं हैं. रिग स्थापना, प्रणाली शोर प्रबंधन, चैनल अभिव्यक्ति, और रिकॉर्डिंग प्रोटोकॉल भी अच्छा प्रयोगात्मक परिणाम के लिए महत्वपूर्ण हैं.
हमारे अनुभव में, इन विश्वसनीय जवानों के गठन के लिए सबसे महत्वपूर्ण पैरामीटर हैं: उच्च गुणवत्ता oocytes, vitelline झिल्ली जल्दी हटाने (उर्फ, "छीलने"), नव खींच धूल से संरक्षित pipettes, चिकनी pipettes, सकारात्मक लागू दबाव का उपयोग करें जब स्नान में प्रवेश समाधान, सील करने से पहले स्नान में संक्षिप्त समय. यह कहा जा रहा है, अनुभव व्यापक रूप से भिन्न होता है और दूसरों के सबसे महत्वपूर्ण कारकों में अपने स्वयं के सेट है.
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Acknowledgments
सिकुड़ समाधान नुस्खा आरडब्ल्यू Aldrich की प्रयोगशाला से है. स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान, राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन, अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन, पेशी Dystrophy एसोसिएशन, डोनाल्ड बी और डेलिया ई. बैक्सटर फाउंडेशन, Klingenstein फंड और तंत्रिका विज्ञान के लिए McKnight बंदोबस्ती: हम निम्नलिखित वित्तपोषी एजेंसियों और नींव समर्थन के लिए धन्यवाद.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Patch Clamp Amplifier & Software | Instrument | HEKA Instruments | EPC-10 | Or other similar device (e.g. HEKA EPC-9 or Axopatch 200B) |
| No. 5 forceps (two pairs) | Tool | Fine Science Tools | ||
| Oocyte shrinking solution | Reagent | Ingredient In mMN-methyl-D-glucamine 220HEPES 10MgCl2 1EGTA 10Aspartic Acid 220KCl 2pH to 7.4 w/ N-methyl-D-glucamine | ||
| woven mesh | 800 um | Spectrum Labs | 146481 |
References
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Sackmann, B., Neher, E. Single-channel Recording. , Plenum Press. New York. (1983).
