Summary
Questo è inteso come una introduzione alla registrazione di patch clamp da ovociti di Xenopus laevis. Esso copre la rimozione della membrana vitellina, la formazione di un sigillo gigaohm (gigaseal), e la conversione facoltativa delle patch al di fuori-out topologia.
Abstract
Dal suo sviluppo da Sakmann e Neher 1, 2, la patch clamp si è affermata come una tecnica estremamente utile per la misurazione elettrofisiologica dei canali ionici singole o multiple nelle cellule. Questa tecnica può essere applicata a canali ionici, sia il loro ambiente nativo ed espresso in cellule eterologhe, come gli ovociti raccolti dalla rana africana artigliata, Xenopus laevis. Qui, descriviamo la consolidata tecnica di registrazione patch clamp da ovociti di Xenopus. Questa tecnica viene utilizzata per misurare le proprietà dei canali ionici espressi sia nelle popolazioni (macropatch) o singolarmente (un solo canale di registrazione). Ci concentriamo sulle tecniche per ottimizzare la qualità della preparazione degli ovociti e la generazione di tenuta. Con tutti i fattori ottimizzato, questa tecnica dà una probabilità di generazione sigillo di successo superiore al 90 per cento. Il processo può essere ottimizzato in modo diverso da ogni ricercatore sulla base dei fattori lui o lei trova la più importante, e vi presentiamo l'approccio che hanno portato al più grande successo nelle nostre mani.
Protocol
Parte 1: Rimozione della membrana vitellina
- Preparare due serie di pinze. Noi preferiamo n ° 5 pinze, dove un gruppo è stata leggermente affilato con una lima. Anche preparare una pipetta di vetro trasferimento da taglio e la lucidatura fuoco un 7 "pipetta Pasteur.
- Consigliato: Per evitare che gli ovociti di scivolare, tagliare un cerchio di griglia (1 quadrati mm) e colla nel fondo di un piatto 60 millimetri Petri. Questo piatto può essere riutilizzata all'infinito se tenuto pulito tra usi.
- Riempire la piastra Petri con una soluzione a metà strada iperosmotico (vedi ricetta) e posto sotto un microscopio da dissezione.
- Rimuovere 1-3 ovociti di Xenopus dalla loro soluzione di incubazione con una pipetta Pasteur e lucido posto nel piatto.
- Attendere 15s - 2 minuti per le cellule di cominciare a ridursi. Tempi più lunghi rendere le cellule più facile da sbucciare, più brevi tempi di cellule sane per l'applicazione di patch.
- Come si contrae il cellulare, la membrana vitellina inizierà a diventare quasi invisibili come uno strato trasparente sopra la cella. Selezionare una cellula sana (senza spirali o difetti) per peeling.
- Con un paio di pinze, prenda delicatamente la membrana vitellina senza danneggiare la membrana plasmatica. Con l'altra, afferrare vicino al luogo stesso e delicatamente strappare la membrana trasparente a parte e libera della cellula.
- Con la pipetta Pasteur, con attenzione spostare la cella alla camera di registrazione. Si noti che la cellula sarà fragile dopo la rimozione vitellino.
Parte 2: generazione Gigaseal
- Riempire una pipetta di registrazione con soluzione salina. Utilizzare il volume minimo di soluzione che rende un buon contatto elettrico con il filo elettrodo in modo da minimizzare capacità pipetta.
- Flick i tempi pipetta diversi per consentire bolle di galleggiare e scivolare sul filo elettrodo.
Applicare una pressione al pipetta riempita. Questo può essere fatto per via orale o con una pompa da acquario un negozio di animali. Questa pressione è fondamentale per mantenere la pipetta pulisce mentre attraversa l'interfaccia liquido e si sposta alla cella. - Trova l'ovocita nella camera e concentrarsi fortemente sul bordo della cella.
- Con la pipetta dal bagno, il centro (fuori fuoco) punta sopra la cella. Questa volta minimizza trascorso in bagno prima generazione di tenuta.
- Cadere la pipetta fino a fuoco vicino alla cella. Portarlo in prossimità (~ 50 micron). Si dovrebbe vedere una piccola distorsione della soluzione spinto fuori la pipetta dalla pressione posteriore.
- Utilizzando il software di patch clamp, verificare la resistenza della pipetta (il nostro obiettivo è circa 3-4 MΩ) e zero la corrente con la tensione di offset.
- Con una pressione positiva sulla pipetta, spostare la punta lentamente verso la cellula durante il monitoraggio della resistenza visivamente o utilizzando un monitor audio che genera un segnale la cui frequenza è proporzionale alla resistenza. Come la punta comincia a toccare il cellulare, la resistenza aumenta.
- Improvvisamente, ma delicatamente, passare da positivo a pressione negativa di circa lo stesso valore assoluto. Resistenza deve aumentare per sigillare formazione.
- La maggior parte del tempo, la formazione di tenuta avviene all'interno di alcuni secondi, a volte 30-60 secondi sono obbligatori.
- Una volta che la resistenza è a 1GΩ, la pressione può essere rilasciato in folle. Avete ora un in-cell patch. Per un inside-out patch, tirare fuori dalla cella rapidamente. Per i fuori-fuori, vedi sotto.
Parte 5: Fuori-out topologia (opzionale)
- Immediatamente dopo aver ottenuto una gigaseal, rottura della membrana. Questo può essere fatto con aspirazione forte, ma noi preferiamo una V 1 impulso di 1 ms. La resistenza dovrebbe scendere a poco più di pipetta della resistenza iniziale.
- Spostare la pipetta dalla cellula lentamente e dolcemente. Si dovrebbe vedere una sezione del tiro cella con la pipetta. Improvvisamente, e nel giro di pochi secondi, la cellula ritornerà e la resistenza dovrebbero immediatamente e simultaneamente tornare a GΩs.
- Ora avete un cerotto nella parte esterna-out configurazione. Il ectodomains di canali ionici incluso è esposto al bagno.
Parte 6: risultati attesi
In generale, le foche maggiore resistenza sono preferibili e più a lungo vissuto. 10 GΩ è una buona indicazione di alta qualità foche. Nella nostra esperienza, le possibilità di ottenere sigilli di questa qualità varia a molti fattori, in particolare delle cellule e pipetta di qualità. Velocità di acquisizione patch può essere superiore al 95% con le cellule sane, pipette pulite, e un ricercatore confermato. Queste patch possono durare per molti minuti e sono adatti per qualsiasi studio elettrofisiologico dei canali ionici espressi in ovociti di Xenopus, tra cui un canale registrazioni.
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Discussion
Ci sono molti parametri di registrazione elettrofisiologica non discusso qui. Installazione impianto di perforazione, il rumore del sistema di gestione, espressione dei canali e protocolli di registrazione sono anche fondamentali per buoni risultati sperimentali.
Nella nostra esperienza, questi sono i parametri più critici per formare guarnizioni affidabile: gli ovociti di qualità, eliminando la membrana vitellina velocemente (aka, "peeling"), utilizzare pipette appena tirato al riparo dalla polvere, pipette liscio, pressione positiva applicata quando si entra in vasca soluzione, in tempi brevi il bagno prima di tenuta. Detto questo, l'esperienza è molto variabile e altri hanno i loro set di più fattori importanti.
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Acknowledgments
Ricetta soluzione restringimento è dal laboratorio di RW Aldrich. Ringraziamo le seguenti agenzie di finanziamento e le fondazioni per il supporto: National Institutes of Health, National Science Foundation, American Heart Association, Associazione distrofia muscolare, il B. e Donald E. Delia Baxter Foundation, il Fondo Klingenstein McKnight e il Endowment for Neuroscience.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Patch Clamp Amplifier & Software | Instrument | HEKA Instruments | EPC-10 | Or other similar device (e.g. HEKA EPC-9 or Axopatch 200B) |
| No. 5 forceps (two pairs) | Tool | Fine Science Tools | ||
| Oocyte shrinking solution | Reagent | Ingredient In mMN-methyl-D-glucamine 220HEPES 10MgCl2 1EGTA 10Aspartic Acid 220KCl 2pH to 7.4 w/ N-methyl-D-glucamine | ||
| woven mesh | 800 um | Spectrum Labs | 146481 |
References
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Sackmann, B., Neher, E. Single-channel Recording. , Plenum Press. New York. (1983).
