Summary
Это сделано для того, как введение в патч зажим записи с Xenopus laevis ооциты. Она охватывает желточной мембраны удаление, формирование gigaohm уплотнение (gigaseal), и дополнительные преобразования патч для вне-из топологии.
Abstract
С момента разработки Sakmann и 1 Неер, 2, патч зажим было определено в качестве чрезвычайно полезный метод для электрофизиологических измерений одного или нескольких ионных каналов в клетках. Эта техника может быть применена к ионные каналы как в их родной среде и выражается в гетерологичных клетках, таких как ооциты собран из африканских когтистых лягушка, Xenopus laevis. Здесь мы описываем устоявшихся техника патч зажим записи из ооцитов Xenopus. Этот метод используется для измерения свойств выразили ионные каналы либо в популяциях (macropatch) или индивидуально (одноканальный записи). Мы делаем ставку на методы максимального качества подготовки яйцеклетки и печатью поколения. Со всеми факторами оптимизированы, эта техника дает вероятность успешного поколения печать более чем на 90 процентов. Процесс может быть оптимизирован по-разному каждым исследователем на основе факторов, которые он или она считает наиболее важными, и мы представляем подход, которые приводят к наибольшим успехом в наших руках.
Protocol
Часть 1: Удаление желточной оболочки
- Приготовьте два набора щипцов. Мы предпочитаем № 5 щипцы, где один набор был слегка заостренными с файлом. Также приготовьте пипетки стеклянные передачи путем обрезки и противопожарной полировка 7 "пипетки Пастера.
- Рекомендуется: Для предотвращения ооцитов от скольжения, вырезать круг из сетки (1 квадраты мм) и клея на дно чашки Петри 60 мм. Это блюдо можно повторно использовать бесконечно, если содержаться в чистоте между применениями.
- Заполните чашку Петри на полпути гиперосмотического решения (см. рецепт) и места, при вскрытии микроскопом.
- Удалите 1-3 ооцитов Xenopus от их инкубации раствора с полированной пипетки Пастера и поместить в блюдо.
- Подождите 15 сек - 2 мин для клетки начинают сжиматься. Дольше раз заставить клетки легче чистить; более короткое время привести к здоровым клеткам для ямочного ремонта.
- Как клетка сжимается, желточной оболочки начнется стать едва заметны, как прозрачный слой над ячейкой. Выберите здоровые клетки (без мутовках или дефектов) для пилинга.
- С одной парой щипцов, мягко понять желточной оболочки без повреждения плазматической мембраны. С другой, держитесь вблизи того же места и аккуратно слезу ясно мембраны друг от друга и без клетки.
- С пипетки Пастера тщательно перемещать ячейки записи камеры. Обратите внимание, что ячейка будет хрупким после удаления желточной.
Часть 2: Gigaseal поколения
- Заполните записи пипетки с раствором. Используйте минимальный объем раствора, что делает хороший электрический контакт с электродной проволоки с целью минимизации пипетки емкостью.
- Флик пипетку несколько раз, чтобы пузырьки плавать и слайдов на электродной проволоки.
Надавите, чтобы заполнить пипетки. Это может быть сделано через рот или с аквариумом насос от зоомагазина. Это давление имеет решающее значение для держать пипетку очищает, как он пересекает жидкость и перемещается в клетку. - Найти ооцитов в камере и сосредоточиться резко на краю клетки.
- С пипетки из ванны, в центре (не в фокусе) наконечник над ячейкой. Это сводит к минимуму время, проведенное в ванну перед уплотнением поколения.
- Оставьте пипетки вниз, в фокусе рядом с ячейкой. Принесите его в непосредственной близости (~ 50 мкм). Вы должны увидеть небольшое искажение решения выталкивают из пипетки от обратного давления.
- Использование программного обеспечения патч зажим, проверить сопротивление пипеткой (наша цель состоит примерно 3-4 МОм) и ноль тока с помощью напряжения смещения.
- С положительного давления на пипетку, перемещать кончиком медленно к ячейке во время контроля сопротивления визуально или с помощью аудио монитор, который генерирует тон, частота которого пропорциональна сопротивлению. Как кончик начинает трогать ячейки, сопротивление будет увеличиваться.
- Неожиданно, но осторожно, переход от положительного к отрицательному давлению примерно такая же абсолютная ценность. Сопротивление должно увеличиться до уплотнения образования.
- Большую часть времени, печать формирование происходит в течение нескольких секунд, а иногда 30-60 секунд не требуется.
- Как только сопротивление в 1GΩ, давление может быть выпущен в нейтральное положение. Теперь у вас есть по-клеточной патч. Для наизнанку патч, вырваться из клетки быстро. Для наружных-выход, см. ниже.
Часть 5: Вне-из топологии (опционально)
- Сразу же после достижения gigaseal, разрыв мембраны. Это может быть сделано с острыми всасывания, но мы предпочитаем 1 V импульсов в течение 1 мс. Сопротивление должно упасть до чуть больше, чем первоначальное сопротивление пипетки.
- Перемещение пипетки от ячейки медленно и плавно. Вы должны увидеть раздел ячейки тянуть с пипеткой. Вдруг, и в течение нескольких секунд, клетка повернет вспять и сопротивление должно немедленно и одновременно возвращение к GΩs.
- Теперь у вас есть патч вне-из конфигурации. Ectodomains любых включенных ионных каналов подвергается ванну.
Часть 6: Ожидаемые результаты
Обычно, чем выше сопротивление уплотнения предпочтительнее и дольше живут. 10 ГОм является хорошим ориентиром для высококачественной печати. По нашему опыту, шансы на получение печатей это качество зависит от многих факторов, в частности, клеток и пипетки качества. Патч ставки заказов может быть более 95% со здоровыми клетками, чистые пипетки, и опытным исследователем. Эти участки могут продолжаться в течение многих минут и подходят для любых электрофизиологические исследования ионных каналов выражаются в ооцитах Xenopus, в том числе одноканальной записи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Есть много параметров электрофизиологических записи не обсуждаются. Буровая установка, система управления шумом, канал выражения, а также записи протоколов все же решающее значение для хороших результатов эксперимента.
По нашему опыту, это наиболее важные параметры для формирования надежного уплотнения: высокое качество ооцитов, удаление желточной оболочки быстро (так называемый, "пилинг"), используйте только что вытащил пипетки защищен от пыли, гладкая пипетки, положительное давление при входе в ванну Решение, краткие раза в ванне до уплотнения. Это, как говорится, опыт варьируется в широких пределах и другие имеют свои собственные наборы из самых важных факторов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Сокращение решение рецепт от лаборатории РАО Aldrich. Мы благодарим следующие финансовые учреждения и фонды поддержки: Национальный институт здоровья, Национальный научный фонд, Американской кардиологической ассоциации, Ассоциации мышечной дистрофии, Дональд Б. и Делия Э. Бакстер Фонда Klingenstein фонд и фонд поддержки McKnight Neuroscience.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Patch Clamp Amplifier & Software | Instrument | HEKA Instruments | EPC-10 | Or other similar device (e.g. HEKA EPC-9 or Axopatch 200B) |
| No. 5 forceps (two pairs) | Tool | Fine Science Tools | ||
| Oocyte shrinking solution | Reagent | Ingredient In mMN-methyl-D-glucamine 220HEPES 10MgCl2 1EGTA 10Aspartic Acid 220KCl 2pH to 7.4 w/ N-methyl-D-glucamine | ||
| woven mesh | 800 um | Spectrum Labs | 146481 |
References
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Sackmann, B., Neher, E. Single-channel Recording. , Plenum Press. New York. (1983).
