Summary
Detta är tänkt som en introduktion till patch clamp-inspelning från Xenopus laevis oocyter. Det omfattar vitelline membran borttagning, bildandet av en gigaohm tätning (gigaseal) och valfria omvandlingen av plåstret på utsidan ut topologi.
Abstract
Sedan dess utveckling genom Sakmann och Neher 1, 2, har patch clamp etablerat sig som en mycket användbar teknik för elektrofysiologiska mätningar av ett eller flera jonkanaler i cellerna. Denna teknik kan tillämpas på jonkanaler i både deras naturliga miljö och uttrycks i heterolog celler, t.ex. oocyter skördats från klor afrikanska grodan, Xenopus laevis. Här beskriver vi den väletablerade tekniken med patch clamp inspelning från Xenopus oocyter. Denna teknik används för att mäta egenskaperna hos uttryckt jonkanaler antingen i populationer (macropatch) eller individuellt (singel-kanals inspelning). Vi fokuserar på tekniker för att maximera kvaliteten i äggcellen förberedelse och tätning generation. Med alla faktorer optimeras, ger denna teknik en sannolikhet för framgångsrik säl generationen över 90 procent. Processen kan optimeras på olika sätt av varje forskare bygger på de faktorer som han eller hon finner viktigast, och vi presenterar den metod som lett till den största framgången i våra händer.
Protocol
Del 1: Ta bort vitelline membranet
- Förbered två uppsättningar av tång. Vi föredrar nr 5 pincett, där en uppsättning har varit något slipas med en fil. Också utarbeta en pipett glas överlåtelse genom putsning och eld-polering en 7 "pasteurpipett.
- Rekommenderas: att förhindra att ägg från att halka, skär en cirkel av galler (1 mm rutor) och lim i botten av en 60mm petriskål. Denna maträtt kan återanvändas på obestämd tid om hålls ren mellan användningarna.
- Fyll petriskål halvvägs med hyperosmotic lösning (se recept) och placera i en dissekera mikroskop.
- Ta bort 1-3 Xenopus ägg från sina inkubation lösning med en polerad pasteurpipett och placera i skålen.
- Vänta 15s - 2 min för celler att börja krympa. Längre tid att cellerna lättare att skala, kortare ledtider till friskare celler för lappning.
- Eftersom cellen krymper kommer vitelline membranet börjar bli knappt syns som ett genomskinligt lager över cellen. Välj en frisk cell (utan virvlar eller fel) för peeling.
- Med en pincett, försiktigt tag i den vitelline membranet utan att skada membranet. Med de andra, ta tag i närheten av samma plats och försiktigt riva den klara membranet isär och fri från cellen.
- Med pasteurpipett försiktigt flytta cellen till inspelningen kammaren. Observera att cellen blir sköra efter vitelline borttagning.
Del 2: Gigaseal generationen
- Fyll en inspelning pipett med koksaltlösning. Använda minsta möjliga volym av lösningen som gör att god elektrisk kontakt med elektroden tråd för att minimera pipett kapacitans.
- Flick pipetten flera gånger så att bubblorna flyta och glida in på elektroden tråd.
Sätta press på den fyllda pipetten. Detta kan göras genom munnen eller med ett akvarium pump från en djuraffär. Detta tryck är avgörande för att hålla pipetten rengör när den passerar vätskan gränssnittet och flyttar till cellen. - Hitta äggcellen i kammaren och fokusera skarpt på kanten av cellen.
- Med pipett ur badet, centrera (oskarp) spets ovanför cellen. Detta minimerar tiden i badet innan tätningen generation.
- Släpp pipetten ner i skarpt fokus intill cellen. Bringa det i närheten (~ 50 mikrometer). Du bör se en liten snedvridning av lösningen trycks ut av pipetten genom mottryck.
- Med hjälp av programvaran patch clamp, kontrollera motstånd pipett (vårt mål är cirka 3-4 Mohm) och noll aktuell med spänning offset.
- Med ett positivt tryck på pipetten, flytta spets långsamt mot cellen under övervakningen motståndet visuellt eller med hjälp av en ljud-bildskärm som ger en ton vars frekvens är proportionell mot motståndet. Som spetsen börjar röra cellen, kommer motståndet att öka.
- Plötsligt men försiktigt växla från positivt till negativt tryck på ungefär samma absoluta värde. Motståndet bör öka för att täta formation.
- Merparten av tiden, sker tätningen bildas inom några sekunder, ibland 30-60 sekunder krävs.
- När motståndet är på 1GΩ, kan trycket släppas till neutral. Du har nu en på-cell patch. För en inside-out plåster, dra bort från cellen snabbt. För utanför ut, se nedan.
Del 5: Utanför ut topologi (tillval)
- Omedelbart efter att uppnå en gigaseal, spricka i membranet. Detta kan göras med skarpa sug, men vi föredrar ett 1 V puls för 1 ms. Motståndet bör sjunka till något mer än den ursprungliga pipetten motstånd.
- Flytta pipetten bort från cellen långsamt och smidigt. Du bör se ett avsnitt av cellen dra med pipett. Plötsligt, och inom några sekunder kommer cellen att gå tillbaka och motståndet bör omedelbart och samtidigt återgå till GΩs.
- Du har nu ett plåster på utsidan ut konfiguration. Den ectodomains av några medföljande jonkanaler är utsatt för badet.
Del 6: förväntade resultat
Generellt högre motstånd tätningar är att föredra och längre levde. 10 GΩ är en bra riktlinje för högkvalitativa tätningar. Vår erfarenhet är chanserna att få tätningar av denna kvalitet varierar beroende på många faktorer, särskilt cell och pipett kvalitet. Patch förvärv priser kan vara över 95% med friska celler, rena pipetter, och en erfaren forskare. Dessa fläckar kan pågå i många minuter och passar för alla elektrofysiologiska studier av jonkanaler som uttrycks i Xenopus oocyter, inklusive enkel-kanal inspelningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns många parametrar elektrofysiologiska inspelning inte diskuteras här. Rigg setup, system för bullerbekämpningen, kanal uttryck, och protokoll inspelning är alla också kritiska till goda experimentella resultat.
Enligt vår erfarenhet, dessa är de mest kritiska parametrarna för att bilda pålitliga tätningar: hög kvalitet ägg, ta bort vitelline membranet snabbt (aka "peeling"), använder nya drog pipetter skyddas från damm, släta pipetter, positivt tryck användas vid inträde i badet lösning, korta tider i badet före tätning. Detta sagt, erfarenhet varierar mycket och andra har sina egna uppsättningar av de viktigaste faktorerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Krympande lösning recept från labbet i RW Aldrich. Vi tackar följande finansiärer och stiftelser till stöd: National Institutes of Health, National Science Foundation, American Heart Association, muskeldystrofi Association, Donald B. och Delia E. Baxter Foundation, Klingenstein fonden och McKnight Endowment for Neuroscience.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Patch Clamp Amplifier & Software | Instrument | HEKA Instruments | EPC-10 | Or other similar device (e.g. HEKA EPC-9 or Axopatch 200B) |
| No. 5 forceps (two pairs) | Tool | Fine Science Tools | ||
| Oocyte shrinking solution | Reagent | Ingredient In mMN-methyl-D-glucamine 220HEPES 10MgCl2 1EGTA 10Aspartic Acid 220KCl 2pH to 7.4 w/ N-methyl-D-glucamine | ||
| woven mesh | 800 um | Spectrum Labs | 146481 |
References
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Sackmann, B., Neher, E. Single-channel Recording. , Plenum Press. New York. (1983).
