Summary
这是为了介绍，从非洲爪蟾卵母细胞来修补钳记录。它涵盖了卵黄膜去除，形成一个gigaohm密封（gigaseal），和可选的补丁外拓扑的转换。
Abstract
由于其发展索克曼和内尔1，2，膜片钳已成为一个极为有用的方法，为单个或多个细胞离子通道的电生理测量。这种技术可以应用到离子通道，在其原生环境，并在异源细胞，如从非洲爪蛙，非洲爪蟾收获的卵母细胞，表达的。在这里，我们描述了补丁钳爪蟾卵母细胞的行之有效的技术。这项技术是用来衡量人口（macropatch）或单独（单声道录音）的表达离子通道的特性。我们专注于技术，以最大限度地提高卵母细胞的制备和密封代质量。随着各方面的因素进行了优化，这种技术提供了一个成功的印章代概率在90％以上。基于他或她认为最重要的因素的每一个研究员，这个过程可能是不同的优化，我们目前的方法，导致在我们手中最大的成功。
Protocol
第1部分：删除卵黄膜
- 准备两套镊子。我们更喜欢5号钳，其中一组已略微削尖文件。修整和抛光火7“巴斯德吸管，还要准备一个玻璃移液管。
- 建议：为了防止打滑的卵母细胞，切圈电网（1毫米广场）和胶成一个60毫米培养皿的底部。此菜可重复使用，无限期如果使用之间保持清洁。
- 高渗溶液（配方），在解剖显微镜下填写的培养皿一半。
- 取出1-3爪蟾卵母细胞，他们采用了抛光的巴斯德吸管和入菜的潜伏期解决方案。
- 等待15秒 - 2分钟为细胞开始萎缩。更长的时间使细胞更容易剥离;较短的时间用于修补导致健康细胞。
- 由于细胞收缩，卵黄膜将开始变得几乎没有一个透明层在细胞中可见。选择一个健康细胞剥皮（不旋涡或缺陷）。
- 随着一对镊子，轻轻抓住，而不破坏质膜的卵黄膜。与其他在同一地点附近，把握轻轻撕除了明确膜和细胞。
- 随着巴斯德吸管，小心地移动到录音室的细胞。注意卵黄去除后，细胞将脆弱。
第2部分：Gigaseal代
- 用生理盐水填充录音吸管。使用体积最小的解决方案，使电极丝具有良好的电接触，以尽量减少移液器电容。
- 弗里克吸管几次，让气泡浮到电极丝滑动。
施加压力，以填补吸管。这可以通过口或从宠物店水族馆泵。这种压力是保持吸管清除，因为它穿过液界面和移动到细胞的关键。 - 查找在会议厅内的卵母细胞和专注于细胞边缘大幅。
- 洗澡，中心（重点）提示的单元格上方吸管。这最大限度地减少所花费的时间在洗澡前密封代。
- 移液器掉落到大家关注的焦点单元格旁边的。使其接近（〜50微米）。您应该看到一个解决方案的失真小，背压推移液器。
- 使用膜片钳软件，检查吸液管的阻力“（我们的目标是大约3-4兆欧）和零电流电压偏移。
- 随着正压移液器，走向细胞的尖端缓慢，同时监测的阻力视觉或使用音频监视器，产生一个音调的频率是成正比的阻力。由于针尖开始接触的细胞，会增加阻力。
- 突然，但轻轻地从正面切换到负压大致相同的绝对值。电阻应增加密封的形成。
- 在大部分时间内，密封的形成发生在几秒钟内，偶尔需要30-60秒。
- 一旦阻力位在1GΩ，压力可以释放至中性。您现在有了一个细胞的修补程序。对于一个由内向外的补丁，细胞迅速拉离。外，见下文。
第5部分：外出拓扑（可选）
- 实现一个gigaseal，膜破裂后立即。尖锐吸，这是可以做到，但我们更喜欢有1 V 1毫秒脉冲。电阻应下降到比最初的吸液管电阻。
- 远离细胞缓慢而平稳地将吸管。您应该看到一个部分的细胞用吸管拉。突然，在几秒钟内，细胞会快速恢复和阻力，应立即并同时返回到GΩs。
- 您现在有一个在外部进行配置的补丁。任何包含离子通道的ectodomains暴露洗澡。
第6部分：预期结果
一般而言，较高的耐药性海豹是可取的和较长的寿命。 10GΩ的是一个高品质的密封良好准则。根据我们的经验，这种品质的密封的机会各不相同的因素很多，尤其是细胞和吸液管的质量。补丁采集率可超过95％，与健康的细胞，干净的滴管，和经验丰富的研究员。这些修补程序可能会持续多分钟，适合任何爪蟾卵母细胞中表达的离子通道，包括单声道录音的电生理研究。
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Discussion
有许多的电生理记录参数，这里不讨论。钻机安装，系统噪声管理，渠道表达，和记录协议都良好的实验结果也很关键。
根据我们的经验，这些都是形成密封可靠，最关键的参数：高品质的卵母细胞，迅速取出卵黄膜（又名“剥皮”），使用新拉的移液器防尘，流畅的移液器，积极施加压力，在入浴时解决方案，在洗澡的简短的时间之前密封。话虽如此，经验差别很大，别人有自己的一组最重要的因素。
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Acknowledgments
从RW Aldrich公司的实验室解决方案处方萎缩。我们感谢以下资助机构的支持和基础：美国国立卫生研究院，唐纳德B.肌肉萎缩症协会，美国国家科学基金会，美国心脏协会，和迪莉娅E.巴克斯特基金会，Klingenstein基金和神经科学的麦克奈特基金会。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Patch Clamp Amplifier & Software | Instrument | HEKA Instruments | EPC-10 | Or other similar device (e.g. HEKA EPC-9 or Axopatch 200B) |
| No. 5 forceps (two pairs) | Tool | Fine Science Tools | ||
| Oocyte shrinking solution | Reagent | Ingredient In mMN-methyl-D-glucamine 220HEPES 10MgCl2 1EGTA 10Aspartic Acid 220KCl 2pH to 7.4 w/ N-methyl-D-glucamine | ||
| woven mesh | 800 um | Spectrum Labs | 146481 |
References
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Sackmann, B., Neher, E. Single-channel Recording. , Plenum Press. New York. (1983).
