Summary
Dit is bedoeld als een kennismaking met klem opnemen patch van Xenopus laevis oöcyten. Het omvat vitelline membraan verwijderen, de vorming van een gigaohm afdichting (gigaseal), en de optionele conversie van de patch naar buiten-out topologie.
Abstract
Sinds de ontwikkeling door Sakmann en Neher 1, 2, is de patch clamp worden opgericht als een zeer nuttige techniek voor elektrofysiologische metingen van enkele of meervoudige ion kanalen in cellen. Deze techniek kan worden toegepast op ionkanalen, zowel in hun eigen omgeving en uitgedrukt in heterologe cellen, zoals eicellen geoogst uit de klauwkikker, Xenopus laevis. We beschrijven hier de gevestigde techniek van patch clamp opnames van Xenopus oöcyten. Deze techniek wordt gebruikt om ofwel het meten van de eigenschappen van ionenkanalen uitgedrukt in populaties (macropatch) of individueel (single-channel-opname). We richten ons op technieken om de kwaliteit van de eicel voorbereiding en zegel generatie te maximaliseren. Met alle factoren geoptimaliseerd, deze techniek geeft een kans van een succesvolle afsluiting generatie meer dan 90 procent. Het proces kan verschillend worden geoptimaliseerd door iedere onderzoeker op basis van de factoren die hij of zij vindt het belangrijkste, en presenteren we de aanpak die moet leiden tot het grootste succes in onze handen.
Protocol
Deel 1: Het verwijderen van de vitelline membraan
- Bereid twee sets van de tang. Wij geven de voorkeur nr. 5 tang, waar een set enigszins is aangescherpt met een vijl. Ook voorbereiden van een glas transferpipet door trimmen en brand-polishing een 7 "Pasteur pipet.
- Aanbevolen: Om te voorkomen dat de eicellen uit te glijden, snijd een cirkel van rooster (1 mm vierkantjes) en lijm in de bodem van een 60 mm petrischaal. Dit gerecht kan onbeperkt worden hergebruikt als u ze schoonmaken tussen toepassingen.
- Halverwege Vul de petrischaal met hyperosmotische oplossing (zie recept) en plaats onder een dissectie microscoop.
- Verwijder 1-3 Xenopus oöcyten uit hun incubatie-oplossing met een gepolijste Pasteur pipet en plaats in de schaal.
- Wacht 15s - 2 min voor de cellen om te beginnen te krimpen. Langere tijden maken cellen gemakkelijker te pellen; kortere leiden tot een gezondere cellen voor het patchen.
- Als de cel krimpt, zal de vitelline membraan begint te worden nauwelijks zichtbaar als een transparante laag over de cel. Selecteer een gezonde cel (zonder kransen of defecten) voor het schillen.
- Met een pincet voorzichtig pakt u de vitelline membraan zonder beschadiging van de plasmamembraan. Met de andere, pak de buurt van de dezelfde plek en voorzichtig uit elkaar scheuren de duidelijke membraan en vrij van de cel.
- Met het Pasteur pipet voorzichtig verplaatst de cel om de opname kamer. Merk op dat de cel zal fragiele na vitelline verwijdering.
Deel 2: Gigaseal generatie
- Vul een opname pipet met een zoutoplossing. Gebruik het minimale volume van de oplossing die een goed elektrisch contact maakt met de draad om pipet capaciteit te minimaliseren.
- Flick de pipet enkele malen te laten bellen om te drijven en schuif op de elektrode draad.
Oefen druk uit op de gevulde pipet. Dit kan gedaan worden via de mond of met een aquarium pomp uit een dierenwinkel. Deze druk is van cruciaal belang om de pipet reinigt als het kruist de vloeistof-interface en verhuist naar de cel. - Zoek de eicel in de kamer en de focus sterk op de rand van de cel.
- Met het pipet uit het bad, in het midden van de (van de focus) tip boven de cel. Dit minimaliseert de tijd doorgebracht in het bad voor de afdichting generatie.
- Laat de pipet naar beneden in scherp naast de cel. Breng het in de nabijheid (~ 50 micron). Ziet u een kleine verdraaiing van de oplossing naar buiten geduwd van de pipet door de tegendruk.
- Met behulp van de patch clamp software, controleer dan de weerstand van de pipet (ons doel is ongeveer 3-4 MΩ) en nul het huidige gebruik van compensatie van de spanning.
- Met een positieve druk op de pipet, langzaam de tip naar de cel, terwijl het toezicht op de weerstand visueel of met behulp van een audio-monitor die een toon waarvan de frequentie is evenredig met de weerstand genereert. Als de tip begint te raken de cel, zal weerstand te verhogen.
- Plotseling maar voorzichtig overschakelen van positief naar negatief druk van ongeveer dezelfde absolute waarde. Weerstand moet verhogen tot de vorming verzegelen.
- Het merendeel van de tijd, sluit de vorming plaatsvindt binnen enkele seconden, zo nu en dan 30-60 seconden nodig.
- Zodra de weerstand op 1GΩ, kan de druk worden vrijgegeven naar neutraal. Je hebt nu een on-cell patch. Voor een inside-out patch, weg te trekken uit de cel snel. Voor buiten-out, zie hieronder.
Deel 5: Buiten-out topologie (optioneel)
- Onmiddellijk na het behalen van een gigaseal, scheuren het membraan. Dit kan gedaan worden met scherpe zuigen, maar wij de voorkeur aan een een V-puls voor 1 ms. De weerstand moet dalen tot iets meer dan de aanvankelijke weerstand pipet.
- Beweeg de pipet uit de buurt van de cel langzaam en gelijkmatig. Ziet u een deel van de cel te trekken met de pipet. Plotseling, en binnen een paar seconden, zal de cel terug snap en de weerstand moet onmiddellijk en tegelijkertijd terug te keren naar GΩs.
- Je hebt nu een patch in de buitenwereld-out configuratie. De ectodomains van een eventueel opgenomen ionkanalen wordt blootgesteld aan het bad.
Deel 6: de verwachte resultaten
In het algemeen hogere weerstand afdichtingen zijn voorkeur en langer leefden. 10 GΩ is een goede richtlijn voor hoogwaardige afdichtingen. In onze ervaring, is de kans op het krijgen van zegels van deze kwaliteit variëren met vele factoren, in het bijzonder cel en pipet kwaliteit. Patch acquisitie tarieven kunnen meer dan 95% met gezonde cellen, schoon pipetten, en een ervaren onderzoeker. Deze patches kan duren voor vele minuten en zijn geschikt voor elke elektrofysiologische studie van ionenkanalen, uitgedrukt in Xenopus oöcyten, waaronder single-channel opnamen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn vele parameters van elektrofysiologische opname hier niet besproken. Rig setup, systeem beheer van vliegtuiggeluid, kanaal expressie, en het opnemen van protocollen zijn ook allemaal van cruciaal belang voor een goede experimentele resultaten.
In onze ervaring zijn dit de meest kritische parameters voor het vormen van een betrouwbare zegels: hoge kwaliteit eicellen, het verwijderen van de vitelline membraan snel (aka, 'peeling'), gebruik dan pas getrokken pipetten beschermd tegen stof, glad pipetten, toegepaste positieve druk bij het betreden van het bad oplossing, korte tijden in het bad voorafgaand aan de afdichting. Dit gezegd zijnde, ervaring varieert sterk en anderen hebben hun eigen sets van de belangrijkste factoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Krimpen oplossing recept komt uit het lab van RW Aldrich. Wij bedanken de volgende financierende instanties en stichtingen voor ondersteuning: National Institutes of Health, National Science Foundation, American Heart Association, spierdystrofie Vereniging, de Donald B. en Delia E. Baxter Foundation, het Fonds en de Klingenstein McKnight Endowment for Neuroscience.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Patch Clamp Amplifier & Software | Instrument | HEKA Instruments | EPC-10 | Or other similar device (e.g. HEKA EPC-9 or Axopatch 200B) |
| No. 5 forceps (two pairs) | Tool | Fine Science Tools | ||
| Oocyte shrinking solution | Reagent | Ingredient In mMN-methyl-D-glucamine 220HEPES 10MgCl2 1EGTA 10Aspartic Acid 220KCl 2pH to 7.4 w/ N-methyl-D-glucamine | ||
| woven mesh | 800 um | Spectrum Labs | 146481 |
References
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Sackmann, B., Neher, E. Single-channel Recording. , Plenum Press. New York. (1983).
