Summary
Dies ist als eine Einführung in die Klemme Aufnahme von Xenopus laevis Oozyten Patch soll. Es deckt Dotterhaut Entfernung, Bildung einer Gigaohm Dichtung (Gigaseal) und die optionale Konvertierung der Patch auf die outside-out-Topologie.
Abstract
Seit der Entwicklung von Sakmann und Neher 1, 2, hat der Patch-Clamp zu einem etablierten und äußerst nützliche Technik für elektrophysiologische Messung von einzelnen oder mehreren Ionenkanälen in Zellen. Diese Technik kann auf Ionenkanäle sowohl in ihrer natürlichen Umgebung angewendet werden und ausgedrückt in heterologen Zellen, wie Eizellen aus dem Krallenfrosch, Xenopus laevis geerntet. Hier beschreiben wir die gut etablierte Technik der Patch-Clamp-Aufzeichnung von Xenopus Oozyten. Diese Technik wird verwendet, um die Eigenschaften ausgedrückt Ionenkanäle entweder messen in der Bevölkerung (macropatch) oder einzeln (Single-Channel-Aufnahme). Wir konzentrieren uns auf Techniken konzentrieren, die Qualität der Eizelle Vorbereitung und Dichtung Generation zu maximieren. Bei allen Faktoren optimiert, bietet diese Technik eine Wahrscheinlichkeit für eine erfolgreiche Abdichtung Generation über 90 Prozent. Der Prozess kann unterschiedlich von jedem Forscher auf die Faktoren, er oder sie findet wichtigste Basis optimiert werden, und wir stellen den Ansatz, die zu den größten Erfolg in unseren Händen haben.
Protocol
Teil 1: Entfernen der Dotterhaut
- Bereiten Sie zwei Sätze von einer Pinzette. Wir bevorzugen Nr. 5 Pinzetten, wo ein Satz wurde leicht hat mit einer Feile geschärft. Auch bereiten ein Glas Transferpipette durch Trimmen und Feuerpolitur ein 7 "Pasteurpipette.
- Empfohlen: Um die Eizellen ein Verrutschen zu verhindern, schnitt einen Kreis von Raster (1 mm Quadrate) und Leim in den Boden einer 60mm-Petrischale. Dieses Gericht kann unbegrenzt wiederverwendet werden, wenn sauber zwischen den Anwendungen.
- Füllen Sie die Petrischale zur Hälfte mit hyperosmotischen Lösung (siehe Rezept) und unter einem Binokular.
- Nehmen Sie 1-3 Xenopus Oozyten aus ihrem Inkubationslösung mit einem polierten Pasteurpipette und Ort in die Schüssel.
- Warten Sie 15s - 2 min für die Zellen beginnen zu schrumpfen. Längere Zeiten machen Zellen leichter zu schälen; kürzere Zeiten zu einem gesünderen Zellen für das Patchen führen.
- Da die Zelle schrumpft, und die Dotterhaut beginnen zu kaum sichtbaren als transparente Schicht über der Zelle. Wählen Sie eine gesunde Zelle (ohne Wirbel oder Defekte) zum Schälen.
- Mit einer Pinzette vorsichtig greifen die Dotterhaut ohne Beschädigung der Plasmamembran. Bei den anderen, in der Nähe der gleichen Stelle zu erfassen und sanft reißen die klare Membran getrennt und frei von der Zelle.
- Mit der Pasteurpipette vorsichtig bewegen die Zelle, um die Aufnahme Kammer. Beachten Sie, dass die Zelle wird nach vitelline Entfernung zerbrechlich.
Teil 2: Gigaseal Generation
- Füllen Sie eine Aufzeichnung Pipette mit Kochsalzlösung. Verwenden Sie die minimale Volumen der Lösung, die guten elektrischen Kontakt mit dem Elektrodendraht um Pipette Kapazität zu minimieren.
- Flick die Pipette mehrmals, damit entstehende Blasen schweben und auf die Elektrode Draht schieben.
Druck auf die gefüllte Pipette. Dies kann durch den Mund oder mit einem Aquarium Pumpe aus einer Tierhandlung gemacht werden. Dieser Druck ist von entscheidender Bedeutung, damit die Pipette reinigt, da es die Flüssigkeit-Grenzfläche und bewegt sich in die Zelle durchquert. - Finden Sie die Eizelle in die Kammer und konzentrieren sich stark auf den Rand der Zelle.
- Mit der Pipette aus der Badewanne, in der Mitte der (unscharf)-Spitze über die Zelle. Dies minimiert die Zeit in der Badewanne, bevor Dichtung Generation ausgegeben.
- Löschen Sie die Pipette nach unten in scharfen Fokus neben der Zelle. Bringen Sie es in unmittelbarer Nähe (ca. 50 Mikrometer). Sie sollten eine kleine Verzerrung der Lösung gedrängt aus der Pipette durch den Gegendruck.
- Mit dem Patch-Clamp-Software, überprüfen Sie den Widerstand der Pipette (unser Ziel ist es ca. 3-4 MOhm) und Null die aktuelle Verwendung der Spannungs-Offset.
- Mit einem positiven Druck auf die Pipette, bewegen Sie die Spitze langsam in Richtung der Zelle während der Überwachung des Widerstandes visuell oder mit Hilfe einer Audio-Monitor, einen Ton, dessen Frequenz proportional zum Widerstand erzeugt. Als die Spitze beginnt, um die Zelle zu berühren, wird Widerstand zu erhöhen.
- Plötzlich aber sanft von positiven Schalter Unterdruck von etwa den gleichen Betrag. Widerstand erhöhen sollte, um die Bildung zu versiegeln.
- Die Mehrheit der Zeit, tritt Siegel Bildung innerhalb von wenigen Sekunden, gelegentlich 30-60 Sekunden benötigt.
- Sobald der Widerstand bei 1GΩ, kann Druck auf neutral erscheinen. Sie haben nun eine On-Cell-Patch. Für eine inside-out patch, ziehen weg von der Zelle rasch. Für Außen-out, siehe unten.
Teil 5: Outside-out-Topologie (optional)
- Unmittelbar nach Erreichen eines Gigaseal, Ruptur der Membran. Dies kann mit scharfen Saug getan werden, aber wir bevorzugen eine 1 V-Impuls für 1 ms. Der Widerstand sollte auf etwas mehr als die erste Pipette Widerstand fallen zu lassen.
- Bewegen Sie die Pipette von der Zelle langsam und gleichmäßig. Sie sollten einen Teil der Zelle ziehen mit der Pipette. Plötzlich und innerhalb von wenigen Sekunden, wird die Zelle wieder einrasten und den Widerstand sollte sofort und gleichzeitig GΩs zurückzukehren.
- Sie haben jetzt einen Patch in der outside-out-Konfiguration. Die Ektodomänen aller enthaltenen Ionenkanäle in das Bad ausgesetzt.
Teil 6: Erwartete Ergebnisse
Generell sind höhere Beständigkeit Dichtungen vorzuziehen und länger lebten. 10 GOhm ist ein guter Richtwert für hochwertige Dichtungen. In unserer Erfahrung, unterscheiden sich die Chancen auf Dichtungen von dieser Qualität mit vielen Faktoren, insbesondere Zell-und Pipette Qualität. Patch-Abtastraten können über 95% mit gesunden Zellen, saubere Pipetten und ein erfahrener Forscher sein. Diese Patches können für viele Minuten dauern und sind für jede elektrophysiologische Untersuchung von Ionenkanälen in Xenopus Oozyten exprimiert, darunter Einzel-Kanal-Aufnahmen geeignet.
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Discussion
Es gibt viele Parameter elektrophysiologische Ableitung hier nicht diskutiert. Rig Setup, sind System-Management-Lärm-, Kanal-Ausdruck, und die Aufnahme Protokolle allem auch entscheidend für die gute experimentelle Ergebnisse.
Nach unserer Erfahrung sind die wichtigsten Parameter für die Bildung zuverlässige Dichtungen: hochwertige Eizellen, die Beseitigung der Dotterhaut schnell (auch bekannt als "Peeling"), verwenden Sie neu gezogen Pipetten vor Staub geschützt, glatte Pipetten, positive Druck beim Betreten des Bades Lösung kurze Zeit in das Bad vor der Versiegelung. Nachdem dies gesagt ist, die Erfahrung ist sehr unterschiedlich und andere haben ihre eigenen Sätze wichtigsten Faktoren.
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Acknowledgments
Schrumpfende Lösung Rezept stammt aus dem Labor von RW Aldrich. Wir danken folgenden Förderorganisationen und Stiftungen für die Unterstützung: National Institutes of Health, National Science Foundation, der American Heart Association, Gesellschaft für Muskeldystrophie, die Donald B. und Delia E. Baxter-Stiftung, die Klingenstein Fonds und der McKnight Endowment for Neuroscience.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Patch Clamp Amplifier & Software | Instrument | HEKA Instruments | EPC-10 | Or other similar device (e.g. HEKA EPC-9 or Axopatch 200B) |
| No. 5 forceps (two pairs) | Tool | Fine Science Tools | ||
| Oocyte shrinking solution | Reagent | Ingredient In mMN-methyl-D-glucamine 220HEPES 10MgCl2 1EGTA 10Aspartic Acid 220KCl 2pH to 7.4 w/ N-methyl-D-glucamine | ||
| woven mesh | 800 um | Spectrum Labs | 146481 |
References
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Sackmann, B., Neher, E. Single-channel Recording. , Plenum Press. New York. (1983).
