Summary
זה נועד כהקדמה תיקון הקלטה מהדק מ ביציות Xenopus laevis. היא משתרעת על הסרת vitelline קרום, היווצרות חותם gigaohm (gigaseal), ואת ההמרה אופציונלי של תיקון כדי טופולוגיה מחוץ הקצוב.
Abstract
מאז הפיתוח שלה על ידי Sakmann ואת נהר 1, 2, מהדק את התיקון הפך הוקמה טכניקה שימושית מאוד עבור מדידה אלקטרו של תעלות יונים יחיד או מספר תאים. טכניקה זו ניתן להחיל על תעלות יונים בסביבה הן מולדתם והביעו בתאים Heterologous, כגון ביציות שנקטפו מן הצפרדע טפרים אפריקה, Xenopus laevis. כאן אנו מתארים את הטכניקה מבוססת היטב של הקלטה תיקון מהדק מ ביציות Xenopus. טכניקה זו משמשת כדי למדוד את המאפיינים של תעלות יונים לידי ביטוי גם באוכלוסיות (macropatch) או בנפרד (יחיד ערוץ הקלטה). אנו מתמקדים וטכניקות על מנת למקסם את איכות הביצית הכנה הדור חותם. עם כל הגורמים אופטימיזציה, טכניקה זו נותנת הסתברות של הדור חותם מוצלח מעל 90 אחוז. התהליך עשוי להיות מותאם באופן שונה על ידי כל חוקר מבוסס על הגורמים הוא או היא מוצאת החשוב ביותר, ואנחנו מציגים את הגישה כי יש להוביל להצלחה רבה בידינו.
Protocol
חלק 1: הסרת הממברנה vitelline
- הכן שני סטים של מלקחיים. אנחנו מעדיפים 5 מס 'מלקחיים, שם קבוצה אחת כבר חידד מעט עם קובץ. כמו כן להכין פיפטה העברת זכוכית ידי זמירה ואת האש ליטוש 7 "פיפטה פסטר.
- מומלץ: כדי למנוע את החלקת ביציות, לחתוך עיגול של רשת (1 ריבועים מ"מ) דבק לתוך החלק התחתון של צלחת פטרי 60mm. מנה זו ניתן לעשות שימוש חוזר ללא הגבלת זמן, אם הזמן לנקות בין השימושים.
- מלאו את צלחת פטרי באמצע פתרון hyperosmotic (ראו מתכון) ומקום תחת מיקרוסקופ לנתח.
- הסר 1-3 ביציות Xenopus מפתרון הדגירה שלהם עם פיפטה פסטר מקום מלוטשים לתוך המנה.
- חכו 15S - 2 דקות עבור תאים להתחיל להתכווץ. פעמים יותר קל להפוך תאים לקלף; זמנים קצרים יותר להוביל תאים בריאים עבור תיקון.
- כאשר התא מתכווץ, הקרום vitelline יתחילו להיות גלוי בקושי כמו שכבה שקופה מעל התא. בחר תא בריא (ללא דורים או פגמים) עבור קילוף.
- עם זוג אחד של מלקחיים, בעדינות לתפוס את קרום vitelline מבלי לפגוע הממברנה הפלסמטית. עם זאת, לתפוס קרוב לאותה נקודה בעדינות לקרוע את קרום ברור מזה חינם של התא.
- בעזרת פיפטה פסטר, בזהירות להזיז את התא לתא הקלטה. שים לב כי התא יהיה שביר לאחר הסרת vitelline.
חלק 2: דור Gigaseal
- מלאו פיפטה הקלטה עם מי מלח. השתמש נפח מינימלי של פתרון זה יוצר מגע חשמלי טוב עם חוט האלקטרודה כדי למזער קיבול פיפטה.
- פליק מספר פעמים כדי לאפשר פיפטה בועות והחלק לצוף על חוט האלקטרודה.
החל הלחץ פיפטה מלא. ניתן לעשות זאת דרך הפה או באמצעות משאבה אקווריום בחנות לחיות מחמד. לחץ זה הוא קריטי כדי לשמור על פיפטה מנקה כפי שהוא חוצה את ממשק נוזל עובר התא. - מצא את הביצית בחדר להתמקד בחדות על קצה של התא.
- בעזרת פיפטה מתוך האמבטיה, במרכז קצה (מחוץ לפוקוס) מעל התא. הפעם ממזער בילה באמבטיה לפני דור חותם.
- זרוק את פיפטה לתוך להתמקד חדה ליד התא. תביאו אותו בסמיכות (~ 50 מיקרון). אתה צריך לראות עיוות קטן של פתרון דחף מתוך פיפטה בלחץ בחזרה.
- שימוש בתוכנה מהדק תיקון, לבדוק את ההתנגדות של פיפטה (המטרה שלנו היא כ 3-4 MΩ) ואפס הנוכחי באמצעות מתח לקזז.
- עם לחץ חיובי על פיפטה, העבר את קצה באיטיות לעבר התא תוך ניטור עמידות ויזואלית או באמצעות צג השמע שיוצר צליל אשר תדירות הוא יחסי ההתנגדות. כאשר קצה מתחיל לגעת התא, התנגדות יגדל.
- פתאום אך בעדינות לעבור חיובי ללחץ שלילי של ערך מוחלט זהה בקירוב. ההתנגדות צריכה להגדיל לאטום היווצרות.
- רוב הזמן, היווצרות חותם מתרחשת תוך מספר שניות, לפעמים 30-60 שניות נדרשים.
- לאחר ההתנגדות היא ב 1GΩ, לחץ יוכלו להשתחרר נייטרלי. כעת יש לך כתם על תאים. עבור תיקון מבפנים החוצה, להתרחק מן התא במהירות. במשך מחוץ החוצה, ראה להלן.
חלק 5: מחוץ הקצוב טופולוגיה (אופציונלי)
- מיד לאחר השגת קרע gigaseal, הממברנה. ניתן לעשות זאת עם יניקה חדה, אבל אנחנו מעדיפים 1 V הדופק עבור 1 ms. ההתנגדות צריכה לרדת על מעט יותר מ ההתנגדות הראשונית פיפטה.
- הזז את פיפטה מן התא לאט בצורה חלקה. אתה אמור לראות קטע למשוך את התא עם פיפטה. לפתע, ותוך כמה שניות, התא יהיה הצמד חזרה ההתנגדות צריך מיד לחזור בו זמנית GΩs.
- כעת יש לך כתם בתצורת מחוץ החוצה. Ectodomains של כל תעלות יונים כלל חשוף באמבטיה.
חלק 6: התוצאות החזויות
באופן כללי, חותמות התנגדות גבוהה עדיפים וחי יותר. 10 GΩ הוא מנחה טוב באיכות גבוהה חותמות. מניסיוננו, את הסיכויים חותמות איכות זו משתנה עם גורמים רבים, במיוחד תא פיפטה איכות. רכישת שיעורי תיקון יכול להיות מעל 95% עם תאים בריאים, טפטפות נקי, חוקר מנוסה. תיקונים אלה עשויים להימשך דקות ארוכות ומתאימים לכל מחקר אלקטרו של תעלות יונים לידי ביטוי ביציות Xenopus, כולל ערוץ אחד ההקלטות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ישנם פרמטרים רבים הקלטה אלקטרו לא נדון כאן. התקנת המתקן, רעש מערכת ניהול, הביטוי הערוץ, ופרוטוקולים הקלטה דבר קריטי גם תוצאות הניסוי טוב.
מניסיוננו, אלו הם הפרמטרים הקריטיים ביותר עבור יצירת חותמות אמין: ביציות באיכות גבוהה, הסרת קרום vitelline מהר (aka, "פילינג"), משך השימוש pipettes החדש מוגן מפני אבק, טפטפות חלקה, לחץ חיובי מוחל בעת הזנת אמבטיה הפתרון, פעמים קצר באמבטיה לפני האיטום. להיות זה אמר, חוויה משתנה מאוד ואחרים סטים משלהם הגורמים החשובים ביותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
מתכון הפתרון הוא כיווץ מהמעבדה של RW אולדריץ'. אנו מודים סוכנויות מימון הבאים היסודות תמיכה: National Institutes of Health, הקרן הלאומית למדע, איגוד הלב האמריקני, איגוד ניוון שרירים, ב 'דונלד E. בקסטר דליה קרן, קרן Klingenstein ולקרן מק' נייט למדעי המוח.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Patch Clamp Amplifier & Software | Instrument | HEKA Instruments | EPC-10 | Or other similar device (e.g. HEKA EPC-9 or Axopatch 200B) |
| No. 5 forceps (two pairs) | Tool | Fine Science Tools | ||
| Oocyte shrinking solution | Reagent | Ingredient In mMN-methyl-D-glucamine 220HEPES 10MgCl2 1EGTA 10Aspartic Acid 220KCl 2pH to 7.4 w/ N-methyl-D-glucamine | ||
| woven mesh | 800 um | Spectrum Labs | 146481 |
References
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Sackmann, B., Neher, E. Single-channel Recording. , Plenum Press. New York. (1983).
