Summary
Bu Xenopus laevis oosit kelepçe kayıt yama için bir giriş olarak tasarlanmıştır. Vitellin membran, bir gigaohm mühür (gigaseal) oluşumu ve dış topoloji yama isteğe bağlı dönüşüm kapsar.
Abstract
Sakmann ve Neher 1, 2, geliştirme bu yana, yama kelepçe hücreleri tekli veya çoklu iyon kanallarının elektrofizyolojik ölçüm için son derece yararlı bir teknik olarak kurulan haline gelmiştir . Bu teknik, kendi doğal ortamında hem de iyon kanalları için uygulanabilir ve heterolog hücreleri, Afrika pençeli kurbağası, Xenopus laevis hasat oosit gibi ifade edilebilir. Burada, Xenopus oositleri yama kelepçe kayıt köklü bir tekniktir açıklar. Bu teknik, bireysel olarak nüfus (macropatch) ya da (tek kanallı kayıt) olarak ifade iyon kanalları özelliklerini ölçmek için kullanılır. Oosit hazırlanması ve conta üretimi kalitesini en üst düzeye çıkarmak için teknikleri üzerine odaklanır. Tüm faktörleri optimize edilmiş, bu tekniğin başarılı conta üretimi yüzde 90 üzerinde bir olasılık verir. Bu süreç, o en önemli buluntu faktörlere dayanan her araştırmacı tarafından farklı olarak optimize edilmiş, ve biz elimizde en büyük başarısı için yol var yaklaşım mevcut olabilir.
Protocol
Bölüm 1: vitellin membran Çıkarma
- Forseps iki set hazırlayın. Biz bir takım hafif bir dosya ile bilenmiş olmuştur No: 5 forseps tercih ediyor. Ayrıca 7 "Pasteur pipeti kırparak ve yangın parlatma, bir cam transferi pipet hazırlar.
- Önerilen: oosit kaymasını önlemek için, ızgara bir daire (1 mm kareler) kesme ve 60mm bir Petri kabı altına yapıştırıcı. Bu yemek, kullanımlar arasında temiz tutulması halinde süresiz olarak yeniden kullanılabilir.
- Bir diseksiyon mikroskobu altında Hiperozmatik çözüm (reçete) ve yeri ile yarım Petri kabı doldurun.
- Çanak içine cilalı Pasteur pipeti ve yer ile inkübasyon çözüm 1-3 Xenopus oositleri çıkarın.
- 15 saniye bekleyin hücreler için 2 dakika küçülmeye başlar. Kat daha uzun kabuğu hücreleri kolaylaştırır, daha kısa sürelerde yama için sağlıklı hücrelere yol.
- Hücre küçülür olarak vitellin zarı, hücre üzerinde şeffaf bir tabaka olarak zor görünür olmaya başlayacaktır. Soymak için sağlıklı bir hücre (loca veya kusurları olmadan) seçin.
- Forseps bir çift ile, plazma membranına zarar vermeden vitellin membran hafifçe kavrayın. Diğeri ile aynı noktaya yakın kavrayın ve yavaşça dışında açık zarı yırtılma ve hücre ücretsiz.
- Pasteur pipeti ile dikkatli bir şekilde hücre kayıt odasına taşıyın. Hücre vitellin çıkarılmasından sonra kırılgan unutmayın.
Bölüm 2: Gigaseal nesil
- Serum fizyolojik ile bir kayıt pipet doldurun. Pipet kapasitans en aza indirmek için elektrot teli ile iyi elektriksel temas yapan çözüm minimum hacim kullanın.
- Elektrot teli üzerine yüzer ve slayt kabarcıkları izin pipeti birkaç kez hafifçe vurun.
Doldurulmuş pipet basınç uygulayın. Bu, ağız yoluyla ya da bir evcil hayvan mağazasından bir akvaryum pompası ile yapılabilir. Bu basınç, sıvı arayüzü ve hücre gider haç gibi pipet temizler tutmak için kritik öneme sahiptir. - Odasında oosit bulun ve hücrenin kenar keskin bir odak.
- Pipet ile banyo, merkezi hücrenin üstündeki (odak) ucu. Bu en aza indirir mühür nesil önce banyo harcanan.
- Hücreye sonraki netleşiyor pipet aşağı bırakın. Yakın (~ 50 mikron) haline getirin. Çözüm küçük bir bozulma, geri basınç pipet itti göreceksiniz.
- Yama kelepçe yazılımı kullanarak, pipet direncini kontrol edin (M hedefimiz yaklaşık 3-4) ve ofset gerilimi kullanarak mevcut sıfır.
- Görsel direnç izleme veya frekans direnci ile orantılı bir ses üretir bir ses monitör kullanırken pipet üzerinde pozitif bir basınç ile, hücre doğru yavaş yavaş ucu hareket. Ucu hücre dokunmaya başladığında, direnç artacaktır.
- Aniden fakat nazikçe yaklaşık olarak aynı mutlak değeri negatif basınç olumlu geçiş. Direnç oluşumu mühür artırmanız gerekir.
- Zaman çoğunluğu, mühür oluşumu birkaç saniye içinde oluşur ve bazen 30-60 saniye gereklidir.
- Direnç 1GΩ sonra, basınç nötr serbest bırakılabilir. Artık on-hücreli bir yama var. Tersyüz olmuş bir yama için, hızla hücre uzak çekin. Dış-çıkış için aşağıya bakın.
Bölüm 5: Dış çıkış topolojisi (isteğe bağlı)
- Gigaseal, rüptür membran ulaşmak hemen sonra. Bu keskin emme, ancak biz 1 V darbe 1 ms için bir tercih olabilir. Direnci ilk pipet direnci biraz daha düşmesi gerekir.
- Pipet yavaşça ve yumuşak bir hücre uzak hareket ettirin. Pipet ile hücre çekin bir bölümünü göreceksiniz. Aniden, ve birkaç saniye içinde, hücre geri yapışır ve direnişin GΩs hemen ve aynı anda dönmelidir.
- Şimdi, dışarıdan yapılandırma bir yama var. Dahil herhangi bir iyon kanalları ectodomains banyosuna maruz kalmaktadır.
Bölüm 6: Beklenen Sonuçlar
Genel olarak, daha yüksek bir direnç mühürler tercih edilen ve uzun ömürlü. 10 GΩ yüksek kaliteli contalar için iyi bir rehber. Deneyimlerimize göre, bu kalite mühürler alma şansını kalitesi özellikle hücre ve pipet birçok faktöre göre değişir. Sağlıklı hücre, temiz pipetler ve deneyimli bir araştırmacı Patch satın alma oranları% 95 üzerinde olabilir. Bu yamalar birçok dakika sürecek ve tek kanallı kayıtları da dahil olmak üzere Xenopus oositleri ifade iyon kanalları, herhangi bir elektrofizyolojik çalışma için uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada tartışılan elektrofizyolojik kayıt birçok parametre vardır. Rig kurulum, sistem gürültü yönetimi, kanal ifadesi, ve kayıt protokolleri iyi deneysel sonuçlar da kritik öneme sahiptir.
Deneyimlerimize göre, bu güvenilir mühürler oluşturan en önemli parametreler şunlardır: banyo girerken yüksek kalitede oosit, (nam-ı diğer "soyma") hızla vitellin membran kaldırarak, tozdan korunan yeni çekilmiş pipetler, pürüzsüz pipetler, uygulanan pozitif basınç çözümü, kapatılmadan önce banyoda kısa kez. Bu varlık deneyimi yaygın olarak değişir ve diğerleri en önemli faktörlerden kendi setleri var, dedi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Daraltma çözüm tarifi RW Aldrich laboratuar. Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Bilim Vakfı, Amerikan Kalp Derneği, Müsküler Distrofi Derneği, Donald B. ve Delia E. Baxter Vakfı, Klingenstein Fonu ve McKnight Endowment for Neuroscience için: Biz aşağıdaki finansman kuruluşları ve vakıflar destek için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Patch Clamp Amplifier & Software | Instrument | HEKA Instruments | EPC-10 | Or other similar device (e.g. HEKA EPC-9 or Axopatch 200B) |
| No. 5 forceps (two pairs) | Tool | Fine Science Tools | ||
| Oocyte shrinking solution | Reagent | Ingredient In mMN-methyl-D-glucamine 220HEPES 10MgCl2 1EGTA 10Aspartic Acid 220KCl 2pH to 7.4 w/ N-methyl-D-glucamine | ||
| woven mesh | 800 um | Spectrum Labs | 146481 |
References
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Sackmann, B., Neher, E. Single-channel Recording. , Plenum Press. New York. (1983).
