Machen Patch-Pipetten und Sharp Elektroden mit einem programmierbaren Puller

Summary

Dieses Video zeigt, wie eine programmierbare Abzieher verwenden, um Patch-Pipetten und scharfen Elektroden für die Elektrophysiologie zu machen. Das gleiche Verfahren kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Glas-Tools, einschließlich Injektionsnadeln zu machen.

Abstract

Glas-Mikroelektroden (auch als Pipetten) haben ein Arbeitspferd der Elektrophysiologie seit Jahrzehnten. Heute sind solche Pipetten von Glaskapillaren erfolgt über eine programmierbare Abzieher. Solche Instrumente Wärme der Kapillare entweder mit einem Metallfaden oder einem Laser und zeichnen sich aus dem Glas mit der Schwerkraft, einen Motor oder beides. Pipetten für Patch-Clamp-Aufzeichnung werden unter Verwendung nur Hitze und Schwerkraft, während scharfe Elektroden für die intrazelluläre Aufnahme verwenden eine Kombination von Wärme, Schwerkraft und einem Motor. Das Verfahren zur intrazellulären Aufnahme Pipetten machen, ist ähnlich, die zur Injektionsnadeln für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich cRNA Injektion in Xenopus Oozyten zu machen. Im Allgemeinen, Kapillar-Glas <1,2 mm im Durchmesser wird verwendet, um Pipetten für Patch-Clamp-Aufnahme zu machen, während engeren Glas für die intrazelluläre Aufnahme (Außendurchmesser = 1,0 mm) verwendet wird. Für jedes Werkzeug ist der Abzieher programmiert etwas anders. Dieses Video zeigt, wie man beide Arten von Aufnahmen Pipetten mit vorher festgelegten puller Programme machen.

Protocol

Pulling Pipetten

Mit einer Mikroelektrode puller wie Sutter P-97 Flaming / Brown, ziehen eine Reihe von etwa 10-20 Pipetten.

1. Wählen Sie Ihre Kapillare aus Glas. Wir verwenden Borosilikat Kapillaren (Sutter BF150-110 bis 10 mm, 1,5 mm Außendurchmesser, 1,1 mm Innendurchmesser, 10 cm lang). Bewahren Sie das Glas vorsichtig damit es sauber und staubfrei bleibt.
2. Entwerfen Sie ein Ziehen Programm. Wir verwenden einen 5-Schritte-Programm, mit absteigender Hitze und Geschwindigkeit bei jedem Schritt, und ein kleiner Zug auf den letzten Schritt. Sutter ist Pipette Kochbuch ist eine hervorragende Referenz für die Entwicklung geeigneter Programme.
3. Untersuchen Sie die Pipettenspitzen unter dem Mikroskop auf Öffnungsdurchmesser und Glätte zu bestimmen. Discard rau, uneben oder unregelmäßig Tipps. Ein guter Zug-Protokoll sollten dafür sorgen, diese sind selten. Für Standard-Patch-Clamp-Aufzeichnung, sollte Bahnöffnungen 1-3 Mikrometer im Durchmesser sein. Ein Steilkegel (stumpfe Spitze) führt zu Widerstand für den gleichen Öffnungsdurchmesser geringer. Form und Größe können durch Druck Polieren modifiziert werden.

Feuerpolieren Pipetten

1. Richten Sie ein Polieren rig (microforge) mit einem Platin-Heizdraht durch ein Fußpedal gesteuert. Ein nützliches Kit ist ab ALA Scientific (CPM-2) oder eine ähnliche Vorrichtung kann stückweise zusammengesetzt werden.
2. Optional: Bestreichen Sie die Pipette mit einem Isolator, um die Kapazität zu verringern und verbessern das Geräuschverhalten. Wir verwenden Dentalwachs. Sylgard 184 ™ (Poly-dimethyl Siloxanelastomer auch als PDMS) ist auch eine Option.
3. Bei der Verwendung von Wachs, halten einen kleinen geschmolzenen Versorgung in der Nähe. Mit Luftdruck auf der Rückseite der Pipette auf Wachs von der Eingabe der Pipette zu halten, tauchen die Spitze kurz in das flüssige Wachs und zu entfernen. Mit Sylgard, speichern vorbereitet Elastomer in gefrorenen Aliquots und malen Sie die Pipettenspitze unter dem Mikroskop. Wärme an das Elastomer zu heilen.
4. Platzieren Sie die Pipette (beschichtet oder nicht) in der Poliervorrichtung und bringen die Spitze ~ 50 Mikron aus dem Filament. Denken Sie daran, dass der Faden dehnt sich bei Erwärmung.
5. Empfohlen: Folgen Sie der separaten Protokoll für "pressure polishing", um die Form der Pipette für optimale Festigkeit und Spitzendurchmesser ändern.
6. Eine kurze Hitze-Impuls (1-2 Sekunden) ist ausreichend, um Wachs, das aus der Spitze der Pipette abnehmen und glatte Glas.
7. Legen Sie die fertigen Pipette in einem geschlossenen Kasten, um vor Staub zu schützen, wiederholen Sie für 10 erfolgreiche Pipetten.

Discussion

Das Protokoll dargestellt ist hier im täglichen Einsatz in der Elektrophysiologie Labor und wird auch zur Injektionsnadeln für Zellen und Tieren zu machen. Mit einer programmierbaren Abzieher, ist es leicht, Pipetten für eine Vielzahl von Anwendungen zu machen. Mit Aufmerksamkeit und Pflege, wird das Filament auf Ihren Abzieher für ein Jahr oder länger dauern. Viel Glück mit Ihrer Experimente.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Micropipette Puller	Instrument	Sutter Instrument Co.	P-97	Or similar instrument (e.g. Sutter P-87 or P-2000)
Glass Capillaries	Reagent	Sutter Instrument Co.	BF150-86-10	Or, similar capillary glass. To make filling the pipette easier, use a capillary with a glass filament.