Summary
Поддерживаемые плоского бислоя являются мощными инструментами, которые могут быть использованы для моделирования молекулярных взаимодействий в иммунологических синапсов. Здесь мы покажем, методы крепления адгезии клеток белков, известных для модуляции формирование синапса на верхний листок липидного bilyer и визуализировать формирование синапса использованием TIRF микроскопии.
Abstract
Поддерживаемые плоского бислоя являются мощными инструментами, которые могут быть использованы для моделирования молекулярных взаимодействий в иммунологических синапсов. Чтобы имитировать взаимодействия между лимфоцитами и антиген представляющих клеток, мы используем Ni2 +-хелатирующие липидов на якорь рекомбинантный адгезии клеток и белков ГКГ на верхний листок бислоя с поли-гистидин теги. Planar бислоев генерируются путем подготовки липидов, лечение стеклянных поверхностей, где будет бислоя форму, а затем формирование бислоя в специализированные камеры с потоком камеру, где лимфоциты будет добавлен. Затем, бислоев взимается с Ni и его с метками рекомбинантные белки не добавляются. Наконец, лимфоциты вводятся в клетку потока и TIRF микроскопия может быть использована для формирования изображения синапса и механизмов, которые контролируют передвижение Т-клеток, участков рецепторов сортировки и участки рецепторов деградации.
Protocol
1. Подготовка липидов
- Для того чтобы связать белки верхней листовку бислоя, мы используем Ni 2 + хелатирующие липиды, которые якорь рекомбинантных белков с поли-гистидин теги. Определенные типы клеток может присоединиться неспецифически с Ni 2 + покрытием бислоев, но Т-клетки, как правило, нет, что делает этот метод оптимальным для изучения активацию Т-клеток.
- Решение липидного бислоя осуществляется путем подготовки решения 20% Ni 2 + хелатирующие липидов и 80% фосфатидилхолина в соответствующих сумм в стеклянную трубку с 1-2 мл хлороформа и метанола.
- Evaporate растворителя в токе азота газа в теплой (30-37 ° С) водой. Это обычно занимает около 15 минут.
- Удалите все оставшиеся растворителя в высоком вакууме, используя лиофилизатор течение 90 минут.
- Растворите липидов в 2% N-октил-глюкозид моющего средства в трис-солевой буфер, который создает решения смешанных моющих средств / фосфолипидных мицелл. Конечная концентрация фосфолипидных должна быть 0,4 мм. Для формирования липосом, диализировать это решение против 3 изменений Трис-солевой удалить моющим средством и формой липосомы. Мы обычно работают с объемами порядка 1 мл с диаметром 6 мм Спектра / Пор № 2 трубки с отрезанными около 10 кДа. Мы осторожны, чтобы исключить любой ы воздушный пузырь, когда зажима труб. Мы обычно стерильных фильтров это решение и делать диализ в чистых условиях, обработка его с помощью 70% этанола стерилизовать перчатки.
- Это решение должно быть кристально чистым. Она хранится под аргоном для предотвращения окисления. Если раствор мутный, то несколькими стенками пузырьки были получены, и вам придется начинать сначала.
2. Определение того, сколько ICAM-1 и МНС оседают на плоских двухслойных
- Для того, чтобы создать эксперимент, в первую очередь необходимо определить, сколько ICAM-1 и МНС оседают на данной площади поверхности Ni 2 + хелатирующие бислоя при заданной концентрации растворимого белка. Для этого депозита бислоев на 5 микрометров бусин диаметром стекло, инкубировать стеклянные бусы с белком решений в условиях, которые приближаются к в потоке клеток, используемых для работы с изображениями, и зачитал плотность связанных белка поток immunofluorometric анализа.
- FITC-меченных антител с известными номерами флуоресцеина одну молекулу используются для обнаружения поверхностных связанных белков. Fluorescein стандартный бисер используется для калибровки потока микрофлуориметр.
- Мы создадим условия, которые приближаются к на антиген-представляющих клеток с 200 molecules/μm2 ИКАМ-1 и 0.2-20 molecules/μm2 И-Эк-MCC91-103 комплекса.
3. Очистка скользит стеклянной крышкой для формирования плоского бислоя
- Planar бислоев форме спонтанно, когда липосомы сливаются, стекло, но только если стекло надлежащим образом очищены.
- При работе с Piranha, мы носим полную защитную одежду, в том числе фартук кислоту и тяжелые, кислотостойкие рукавицы. Аккуратно отделить отходы из органических отходов и утилизировать должным образом.
- Для приготовления раствора кислоты Piranha, добавляют 75 мл концентрированной серной кислоты в сухой стакан и осторожно добавляют 25 мл 30% перекиси водорода. Решение быстро нагревается до температуры выше 100 ° C.
- Погрузите сухих покровных в раствор на 15 минут. Удалить из раствора и промыть в очищенной воде на минуту с каждой стороны. Сухие покровные использованием источника вакуума для отвода очищенной воды. Разрешить Piranha решение для охлаждения, а также добавлять в контейнер Piranha отходов, который остается с крышкой свободно, хорошо заметны в вытяжном шкафу. Когда все липосомы, покровные, и белки готовы, иммунологических синапсов готова быть сформирована.
4. Формирование бислоя
- Для формирования бислоев, нашей лаборатории используются Bioptechs FCSII камер, которые имеют преимущества интегрированного отопления. Система FCSII на базу из нержавеющей стали, что зажимы вместе микрожидкостных многообразие с 0,5 мм сверху прокладкой, microaqueduct слайд покрытый оксид индия и олова на отопление на одну из поверхностей, с жидкостный паз на другой стороне, без пыли 0,25 мм прокладку, которая определяет высоту камеры потока и Piranha очищены 40 мм выстрел покровное, на котором бислой образуется.
- Хотя покровным стеклом, на котором бислой образуется, должен быть очень гидрофильных и чистая, microacqueduct слайд на самом деле работает лучше, если это более гидрофобным. Создание microaqueduct более гидрофобных достигается, рассматривая его с 1% HSA в течение 60 минут при комнатной температуре, затем мытье с чистой водой и сушки полностью после этого процесса кондиционирования, а также между применениями. Покрытие денатурированные белки оставленные эта процедура позволяет 1 мкл липосом подвески сформировать круглые, hemisphericaл капля, которая> 0,25 мм.
- Чтобы собрать ячейка потока и форму плоского бислоя, место многообразие, трубы направлены вверх, на плоской поверхности. Затем поместите 0. 5 мм прокладка с отверстиями располагается над жидкостных труб, убедившись, что он сидит квартиры. Аккуратно microaqueduct стороны на прокладку жидкостных каналов вверх, и убедитесь, что места квартиру без применения каких-либо понижательное давление, пока не будет установлено, что отверстия в слайд согласования с микрожидкостных труб. Положите пыли 0,25 мм прокладка с прямоугольным вырезать в верхней части microaqueduct слайд так, чтобы канал выстроились с жидкостных каналов и Есть никаких серьезных пробелов воздуха.
- Место до 5 х 1 мкл капель липосомы подвески на поверхности microaqueduct слайда в рисунок так, что от центра до центра расстояние между каждой капли составляет 2,5 мм. 5 капель липосомы могут иметь различные композиции, но в этом случае мы будем только образуют две двойные слои, один, без Ni 2 + + хелатирующие липидов и один с 10% Ni 2 + + хелатирующие липидов.
- После того как эти капли на место, осторожно поместите покрытие скольжения вниз на поверхность в одно движение. Зажим на базу как можно быстрее. Липосомы капли должны вступить в контакт с покровным стеклом. Этот контакт не должна быть нарушена, так как бислоев, наверное, уже сформирован, любые сбои могут привести к дефектной бислоев.
- Важно помнить, чтобы отметить позиции бислоев с нескольких небольших пятен краски на microacqueduct слайд, чтобы помочь позиционирования покровного на микроскопе. Подождите 20 минут, чтобы убедиться, что система обладает уравновешенным. Перенесите все решения с использованием 20 мл шприца, соединенного около 20 см гибких насосно-компрессорных и 3-полосные краном. Подключите другой порт кран для проточной ячейке с помощью короткой длине трубы, чтобы минимизировать мертвый объем между краном и проточную ячейку. Заполните шприц с HEPES-солевой буфер, содержащий 2 мМ MgCl 2, 1 мМ CaCl 2, 5 мМ глюкозы и 1% человеческого сывороточного альбумина.
- Премьер трубы и кран так Есть нет пузырьков воздуха. Подключите к потоке клеток и протолкнуть 5 мл в одно движение во время просмотра, чтобы убедиться, что никаких пузырьков воздуха переходит бислоя. Теперь у вас будет свой бислоев.
Это видео статьей поддерживает "Охотник на Gatherer и обратно: Иммунологические синапсов и Kinapses как вариации на тему амебоидных Locomotion" от Michael L. Дастин , Ежегодный Обзор сотового и биологии развития , том 24, 2008.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.