Summary
Основные, но уникальные свойства грызунов обонятельной системы, привели к увеличению его исследование, проведенное среди биологов. Относительно простые оценки ее функции, то и нужны. Здесь мы опишем чувствительные тесты для характеристики мыши обонятельной чувствительности и предпочтения.
Abstract
Грызун обонятельная система имеет все больший интерес ученых, изучал, в частности, в биологии системы из-за его стереотипный, но доступные схемы. Кроме того, уникальная способность этой области, чтобы генерировать новые нейроны на протяжении всей жизни организма, делает его привлекательным для развития системы и регенеративной биологии, так. Такой интерес необходимым средством для быстрого, но достоверной оценки обонятельной функции. Многие испытания обонятельные способности являются сложными, переменная или нет, специально предназначенных для мышей. Кроме того, некоторые тесты чувствительны к дефициту памяти, а также дефекты в обонятельных способностей, смешанные полученных результатов.
Здесь мы рассмотрим простую батарею тестов с целью выявления дефектов в обонятельную чувствительность и предпочтения. Во-первых, начальная общая оценка здоровья позволяет для идентификации животных, пригодных для дальнейшего тестирования. Во-вторых, мышей подвергаются различным разведения ароматы, чтобы выяснить, есть ли порог разницы. В-третьих, мышей представлены различные ароматы, привлекательные и отвращение, которые позволяют для оценки обонятельных предпочтений. Эти простые исследования должны внести первоначальный характеристика обонятельного поведения доступны для лабораторий различного ресурсов и опыта.
Protocol
Общее состояние здоровья экзамен
Более комплексное лечение общих экзаменов для здоровья могут быть найдены в отличном поведенческих ресурсов фенотипирование Жаклин Кроули, Что не так с моей мыши? 1. Сначала мы используем модифицированную наблюдений батареи тест для оценки общего состояния здоровья субъекта. Батарея включает в себя элементы из комплексной оценки протокол Сэмюэл Ирвина 2 быстро определить те предметы, которые будут непригодны для дальнейшего тестирования. Короче говоря, изменение батареи идентифицирует животных, которые физически ненормальных (например, испытывает серьезную нехватку или избыточной массой тела, плохо ухоженные, dyspneic) или которые проявляют ненормальное положение, передвижения или поведения. Все это может быть проявлением болезни. Любые первоначальные оценки, которые аналогичным образом идентифицирует нездоровый субъектов является целесообразным.
Важно также отметить, что животные используются гуманно как во время общего экзамена здоровья, а также в ходе последующих испытаний. Нет анестезии или обезболивания используется как эти тесты не включают любые потенциально болезненных процедур.
Обонятельные тестирования чувствительности
Этот тест предназначен для выявления различий в обонятельной чувствительности между двумя группами мышей (например, дикого типа и мутанта группа животных). В этом тесте несколько разведений аромат сделаны. Наивный животного затем исследует одно разведение этот запах и общий исследовательский время (в течение 3 минут) записываются. Несколько разведения аромат тестируются на другой, наивные предметов и общая поисковых время используется для генерации ответа дозы кривые для каждой группы мышей. Два исследователя должны участвовать в тестировании, с одной слепой подвергать генотипов и / или состояния.
Первичный исследователь
- Получить четыре чистых клетках (8 В х 10 Вт х 18 л, в дюймах), и все это без постельных принадлежностей. Выстроить четыре клетки в кабинет биобезопасности.
- Настройка разделов между каждой арене использованием непрозрачных фильтровальную бумагу. Место черную доску плакат через окончательное разбиение, что черные линии стороны в сторону и нижней части клетки. Обложка верхней части арены с ясным кусок оргстекла, чтобы свет для освещения арены.
()
(Б) 
Рисунок 1. Arena Set-Up. () Правильно драпированные, пустой арене (б) Arena с предметом и душистые фильтровальную бумагу. - Начните приучая предметам. Место первая тема в первую клетку для привыкания. Через 15 минут, перемещать первая тема на второй клетке. Чистая первой клетке с Quatricide ТБ. Далее, поместите второй теме в первом, очистить клетку. Продолжайте этот процесс с последующим предметам. В конечном счете, каждого субъекта должно быть привыкли во всех трех клетках перед помещением на арене (четвертая и последняя клетка) в течение еще 15 минут привыкания перед тестированием.
(Б) 
Слепой исследователь
- Сделайте необходимое количество 2 дюйма на 2 дюйма квадратов фильтровальная бумага для аромата образцов.
- Использование предварительно отобранных ароматом, соответствующим образом разбавить его. Для гидрофобных образцов, таких как арахисовое масло, использовать нефть в качестве растворителя, а для всех остальных, используйте дистиллированную воду. Vortex.
- Установить для цифровых устройств записи видео в дальний конец кабинета биобезопасности, что весь конец клетке находится в фокусе. Возьмите предварительный видео для обеспечения параметров адекватной.
- Запись порядок, в котором разведения будут проверены, заботясь, чтобы случайный порядок испытаний.
- Запись субъекта мусора и идентификационных номеров.
- Как только вопрос был привыкли в течение 15 минут на арене, начать подготовку к первому суда. Внесите первый разбавления вверх и вниз по конической трубе до пипетирования его на фильтр квадратных бумаги. Фильтрующей поверхности бумаги должны быть оптимально ~ 85% покрыта (около 0,50 мл раствора). Используйте kimwipe, чтобы убедиться, фильтровальная бумага не слишком насыщен.
- Начало записи видео.
- Место фильтр квадратных бумаги в клетку на противоположном конце текущего положения животного.
- Начало времени.
- Через 3 минуты, остановить запись и удалить разбавленный запахом.
- Если только один аромат (например, корица) должна быть испытана, удалите первый испытуемый с арены. Повторите шаги 6-11 для каждого животного, соответственно разбавления аромат для каждого предмета. Если более чем один аромат для которого требуется проверить, однако, не снимают испытуемого с арены. Вместо этого, начните времени.
- Надлежащим разбавить следующий аромат с использованием тех же методов, перечисленных выше.
- Через 1 минуту начать видеозапись. Место фильтр квадратных бумаги с разбавлением следующий аромат в клетке на противоположном конце текущего positio животногоn.
- Повторите шаги 6-13 для каждого аромата, отметив, количество видео-файл для каждого испытания.
- Повторите шаги 6-14 для каждого предмета.
Рисунок 2. Представитель результатов сессии тестирования обонятельной чувствительности. Каждая мышь либо из контрольной группы (группа А) или экспериментальной группе (группа В) был выставлен один из пяти различных разведений экстракта корицы на фильтровальную бумагу для одного, три минуты сессии. Оплачивается время изучает фильтровальной бумаги оценивали. Мыши в группе имеют больше обонятельной чувствительности, чем в группе В.
Обонятельные предпочтения Тестирование
Этот тест предназначен для выявления конкретных недостатков обнаружения, а именно способность ощущать притяжение или отвращение ароматов. Следующая процедура занимает либерально из протокола Кобаякава, К. и др. al.3. Опять же, два исследователя должны участвовать в тестировании, с одной слепой подвергать генотипов и / или состояния. Общий исследовательский время снова записал (на просмотр видео) для различных ароматов. Эти ароматы общей поисковой раз больше, чем воды обозначаются как "привлекательную", а тех, кто раз меньше, чем воды, называются "отвращение". Затем исследователь считает ли тот же ароматы "привлекательный" или "неприятных" для разных испытуемых.
Пожалуйста, выполните шаги 1-3 в разделе Тестирование обонятельной чувствительности для первичного исследователя.
Слепой научный
Процедура тестирования обонятельные предпочтения то же самое, с небольшими изменениями шагов 2 и 4. Пожалуйста, повторите шаги 1-15 в разделе Тестирование обонятельной чувствительности для слепых исследователь, со следующими изменениями: Для шаг 2, используя предварительно выбранных ароматов (сочетание привлекательной и отвращение ароматы), сделать надлежащим разбавленных растворов каждого из них в конических труб. Для гидрофобных образцов, таких как арахисовое масло, использовать нефть в качестве растворителя, а для всех остальных, используйте дистиллированную воду. Vortex. На шаге 4, а не записи разведения пройти тестирование, запись порядок разнообразными ароматами, которые будут проверены, случайной порядок испытаний.
Этот тест предназначен для выявления конкретных недостатков обнаружения, а именно способность ощущать притяжение или отвращение ароматов. Следующая процедура занимает либерально из протокола Кобаякава, К. и соавт. 3. Опять же, два исследователя должны участвовать в тестировании, с одной слепой подвергать генотипов и / или состояния. Общий исследовательский время снова записал (на просмотр видео) для различных ароматов. Эти ароматы общей поисковой раз больше, чем воды обозначаются как "привлекательную", а с раз меньше, чем воды, называются "отвращение". Затем исследователь считает ли тот же ароматы "привлекательный" или "неприятных" для разных испытуемых.
Пожалуйста, выполните шаги 1-3 в разделе Тестирование обонятельной чувствительности для первичного исследователя.
Слепой научный
Процедура тестирования обонятельные предпочтения то же самое, с небольшими изменениями шагов 2, 4 и 13. Пожалуйста, повторите шаги 1-15 в разделе Тестирование обонятельной чувствительности для слепых исследователь, со следующими изменениями: Для шаг 2, используя предварительно выбранных ароматов (сочетание привлекательной и отвращение ароматы), сделать надлежащим разбавленных растворов каждого из них в конических труб. Для гидрофобных образцов, таких как арахисовое масло, использовать нефть в качестве растворителя, а для всех остальных, используйте дистиллированную воду. Vortex. На шаге 4, а не записи разведения пройти тестирование, запись порядок разнообразными ароматами, которые будут проверены, случайной порядке, в каждом испытании. Для шага 13, место фильтр квадратных бумаги следующий аромат в клетке на противоположном конце текущего положения животного.
Рисунок 3. Представитель результатов сессии тестирования обонятельных предпочтений. Каждая мышь подвергался каждый из различных ароматов на фильтровальную бумагу для одного, три минуты сессии. Оплачивается время изучает фильтровальной бумаги оценивали. Арахисовое масло и ваниль привлекательные ароматы (разведочные аромат времени> исследовательский вода времени) и 2-Methylbutyric Кислота отвращение (разведочные аромат время <поисковых вода времени).
Подсчет очков в обонятельной Тесты
После приобретения всех обонятельных чувствительности и предпочтение видео, необходимо проанализировать общее время, проведенное изучение каждого разведения / аромат. У слепого исследователем анализировать все видео последовательности.
- Предварительный просмотр VIDео, отметив следующее: а) когда фильтровальной бумаги помещают на арене, б) когда мышь подходы фильтровальную бумагу, в) когда мышь исследует фильтровальной бумаги и г), когда за три минуты прошло (с момента, когда фильтр документ был размещен на арене). Зная, когда, чтобы сосредоточиться на поведении мыши облегчает точно оценка общего времени, проведенного в прогулках по обзору.
- Обзор видео. Обратите внимание на время, когда мышь первый исследует фильтровальной бумаги (задержки).
- Использование секундомера, время все расследования в течение трех минут размещения фильтровальной бумаги на арене. Время расследования определяется как любое время, когда ноздри мыши являются <1 мм от фильтровальной бумаги. Важно не включать любые времена, когда мышь находится в непосредственной близости к фильтровальной бумаге, но не активно изучают его. Не включайте приступы жевательных и облизывая бумагу или приступы сидя на бумаге в общем поисковых времени. Необходимо придерживаться тесно и последовательно, чтобы эти правила точно проанализировать обонятельного поведения.
- Запись времени задержки, общее время, проведенное расследование фильтровальной бумаги и количество видео файлов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Вышеупомянутые тесты позволяют для быстрой и надежной оценки основных обонятельных функций. Не следует упускать из виду, однако, что эта надежность требует правильного подбора и подготовки вопросов для тестирования. Животные, которые больны или иначе недееспособным, часто несовместимых испытуемых. Кроме того, привыкание испытуемых является ключевым фактором. Мы обнаружили, что использование нескольких клетках во время привыкания процесс позволяет животным привыкнуть к экспериментатору обработки и изменения окружения. Мы также обнаружили, что раз короче, чем те, которые указаны для привыкания не являются достаточными, чтобы уменьшить беспокойство. Стремясь животных также часто непредсказуемы испытуемых и может скрыть истинные различия.
В реальном тестировании мышей, важно не только быть последовательными при приобретении данных, но и при анализе поведения субъектов. Мы сочли целесообразным рассчитывать только тогда, когда нос испытуемого является <1 мм от фильтровальной бумаги как часть общего поискового времени. Кроме того, поведение, такое как кусаться или жевательной фильтровальной бумаги не включены в общий исследовательский времени. Кроме того, задержка времени (привлекательные ароматы) также может быть полезным метрики. Различные фоны мышей могут потребоваться различные разведения ароматы для эффективного дискриминации между контрольной и опытной группе. Кроме того, важно, чтобы пол-матча и возрастные матча пар. Мы обнаружили, что полезно эмпирически получить соответствующие разведения аромат (по темам, похоже на контрольную группу), прежде чем приступить к экспериментальной проверки наивно мышей. Наконец, эти тесты были выбраны, чтобы минимизировать последствия любых других нарушений познавательной, прежде всего, недостатки в обучении и / или памяти. В связи с этим, очень важно использовать наивно мышей для тестирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Финансирование: Эта работа была поддержана Стюарт HQ & Виктория Quan Predoctoral стипендий (RMW), NIH Pioneer Award (РАН)
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutyric acid | Reagent | Sigma-Aldrich | W269506 | Concentrations Used:9.16 x 10-1 – 10-8 M (in H20) |
| Pure Vanilla Extract | Reagent | McCormick & Co. | n/a | Concentrations Used:10-1 – 10-5 dilution (in H20) |
| Peanut Butter (Skippy, Extra Crunchy) | Reagent | Unilever | n/a | Concentrations Used:10% (w/v), in mineral oil |
| Cinnamon Extract | Reagent | McCormick & Co. | n/a | Concentrations Used:10-1 – 10-5 dilution (in H20) |
| Mineral Oil, light | Reagent | Fisher Scientific | O121-1 | Concentrations Used:N/A |
References
- Crawley, J. N. What’s Wrong with my Mouse? Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice. , John Wiley and Sons. 42-60 (2007).
- Irwin, S. Comprehensive observational assessment: Ia. A systematic, quantitative procedure for assessing the behavioral and physiologic state of the mouse. Psychopharmacologia. 13, 222-257 (1968).
- Kobayakawa, K. Innate versus learned odour processing in the mouse olfactory bulb. Nature. 450, 503-508 (2007).
