Summary
Kemirgen koku alma sisteminin temel karşın benzersiz özellikleri biyologlar arasında artan çalışmaya yol açmıştır. Işlevi nispeten basit bir değerlendirme daha sonra da ihtiyaç vardır. Burada fare koku alma hassasiyeti ve tercih karakterizasyonu için hassas testler açıklar.
Abstract
Kemirgen koku alma sistemi, sistem biyolojisi, basmakalıp, ama ulaşılabilir bir devre nedeniyle kısmen çalışılan bilim adamları, giderek daha çok ilgisini çekmektedir. Buna ek olarak, bir organizmanın hayatı boyunca yeni nöronlar oluşturmak için bu alanda benzersiz yeteneği hem gelişimsel ve rejeneratif biyologlar için cazip bir sistem haline getirmektedir. Bu ilgi, koku alma fonksiyonu hızlı, güvenilir bir değerlendirme için bir araç gerektirir. Koku alma yeteneği çoğu testlerin fareler için özel olarak tasarlanmış karmaşık, değişken ya da değil. Ayrıca, bazı testler bellek kusuru yanı sıra koku alma yetenekleri, karıştırıcı elde edilen sonuçlar hatalarına karşı duyarlı.
Burada koku alma hassasiyeti ve tercih kusurları belirlemek için tasarlanmış basit bir pil testleri açıklar. Birincisi, ilk genel sağlık değerlendirmesi daha fazla test için uygun hayvanların tanımlanması için sağlar. İkincisi, fareler, bir eşik farkı olup olmadığını tespit etmek için çeşitli kokular dilüsyonları maruz kalmaktadır. Üçüncü olarak, fareler koku alma tercih değerlendirilmesi için izin çekici ve caydırıcı hem de çeşitli kokular, sunulmaktadır. Bu basit çalışmalar, çeşitli kaynakları ve uzmanlık laboratuvarları için erişilebilir koku alma davranışları ilk karakterizasyonu yapmak gerekir.
Protocol
Genel Sağlık Sınavı
Genel sağlık muayeneleri daha kapsamlı bir tedavi Jacqueline Crawley mükemmel davranış fenotipleme kaynak bulunabilir, ne benim Mouse ile yanlış? 1. Önce, konunun genel sağlık değerlendirmek için modifiye edilmiş bir gözlemsel test bataryası kullanın. Pil daha fazla test için uygun olacak bu konuları hızlı bir şekilde tanımlamak için Samuel Irwin kapsamlı bir değerlendirme protokolü 2 öğeler içerir. Kısacası, modifiye pil fiziksel anormal hayvanlar tanımlar (örneğin, ciddi ya da aşırı kilo, kötü bakımlı, dyspneic) ya da bu sergi anormal postür, hareket veya davranışları. Bunların hepsi hastalık belirtileri olabilir. Sağlıksız konularda benzer tanımlar herhangi bir başlangıç değerlendirmesi uygun olur.
Hayvanların yanı sıra, sonraki testler sırasında genel sağlık muayenesi sırasında insanca hem de kullanılmakta olduğunu da not etmek önemlidir. Bu testlerin herhangi bir potansiyel ağrılı işlemler dahil gibi, herhangi bir anestezi veya analjezi kullanılır.
Olfaktör Duyarlılık Testi
Bu test, iki grup arasında (örneğin bir yabani tip ve mutant hayvanlar grubu) farelerin koku alma hassasiyeti bir fark tespit etmek için tasarlanmıştır. Bu testte, bir kokusu birden fazla dilüsyonları yapılır. Naif bir hayvan daha sonra bu koku ve toplam keşif süresi 3 dakika içinde tek bir seyreltme kaydedilir inceler. Kokusu birden fazla dilüsyonları farklı, saf konularda test edilir ve toplam keşif farelerin her grup için doz yanıt eğrileri oluşturmak için kullanılır. Iki araştırmacı bir konu genotipler ve / veya durum kör test yer almalıdır.
İlköğretim araştırmacı
- Dört temiz kafeslerde (8 inç cinsinden H x 10 W x 18 L), tüm yataklar olmadan alın. Biyogüvenlik kabini dört kafesleri hizaya getirin.
- Opak filtre kağıdı kullanarak her arenada arasındaki bölümleri ayarlayın. Final bölüm boyunca siyah bir poster koyun gibi siyah yan çizgiler yan ve alt kafesin. Pleksiglas açık bir parça ışık arenada aydınlatmak için izin arena üst kapağı.
(A)
(B) 
Şekil 1. Arena Set-Up (a) Düzgün bol dökümlü, boş bir arenada (b) Arena konu ve kokulu filtre kağıdı . - Konularda habituating başlayın. Ilk konu için ilk alışma kafesine yerleştirin. 15 dakika sonra, ikinci kafesine ilk konu taşıyın. Quatricide TB ilk kafes temizleyin. Sonra, ilk temizlenir, kafes içinde ikinci konu yerleştirin. Sonraki konular ile bu işleme devam edin. Sonuçta, her konu, her üç test alışkanlık önce bir 15 dakika için arenada (dördüncü ve son kafes) sunulmadan önce kafeslerde alışmış olmalıdır.
(B) 
Kör araştırmacı
- 2 inç uygun bir numarası koku örnekleri için filtre kağıdı 2 inç kare olun.
- Önceden seçilmiş bir koku kullanarak, uygun şekilde seyreltilmiş. Fıstık ezmesi gibi hidrofobik örnekleri için, çözücü olarak yağ kullanmak; tüm diğerleri için, distile su kullanın. Vorteks.
- Tüm kafes sonuna odak olduğunu biyogüvenlik kabini ucunda bir dijital video kayıt cihazı olarak ayarlayın. Parametreler yeterli olduğundan emin olmak için bir ön video çekin.
- Dilüsyonları, test çalışmaların amacıyla rastgele özen olacağı sipariş kaydedin.
- Kayıt konu çöp ve kimlik numaraları.
- Sonra konu, ilk deneme için hazırlık başlar, 15 dakika arenada alışmış olmuştur. Bir filtre kağıdı kare üzerine pipetleme önce konik tüp ilk seyreltme ve aşağı yukarı Pipet. Filtre kağıdı yüzeyi ~ 85% kapalı (çözüm yaklaşık 0.50 ml) en iyi şekilde olmalıdır. Filtre kağıdı aşırı doymuş olmadığından emin olmak için bir kimwipe kullanın.
- Video kayıt başlayın.
- Hayvan mevcut konumunu ucunu kafes filtre kağıdı kare yerleştirin.
- Zamanlama başlayın.
- 3 dakika sonra, kayıt, durdurma ve seyreltilmiş kokusunu çıkarmak.
- Sadece bir koku (örn. tarçın) test edilecek ise, ilk test konu arena çıkarın. Tekrar, her konu için uygun bir koku seyreltilmesi, her bir hayvan için 6-11 adımları. Birden fazla koku test edilecek ise, ancak, arenada test konu kaldırmak yoktur. Bunun yerine, zamanlama başlar.
- Uygun yukarıda listelenen aynı yöntemleri kullanarak bir sonraki kokusu sulandırmak.
- 1 dakika sonra, video kayıt başlar. Hayvan mevcut positio ucunu kafes bir sonraki kokusu seyreltme ile filtre kağıdı kare yerleştirin.n.
- Tekrar, her deneme için video dosya numarasını belirterek, her koku için 6-13 adımları.
- Tekrar her konu için 6-14 adımları.
Şekil 2. Koku alma hassasiyeti test bir oturum Temsilcisi sonuçlar kontrol grubu (Grup A) ya da deney grubu (Grup B) Her bir fare tarçın beş farklı dilüsyonları biri üç dakikalık seans için filtre kağıdı ayıklamak birine maruz kalmıştır . Toplam süre filtre kağıdı değerlendirildi keşfetmek geçirdi. Grup Fare Grup B'de daha büyük bir koku alma hassasiyeti
Olfaktör Tercihi Test
Bu test, yani belirli algılama eksiklikleri, çekici ya da caydırıcı kokular anlamda yeteneği belirlemek için tasarlanmıştır. Aşağıdaki yordamı Kobayakawa, protokol, K., ve ark. Al.3 bolca ödünç alır. Yine, iki araştırmacı bir konu genotipler ve / veya durum kör, test dahil edilmelidir. Toplam keşif süre sonra tekrar çeşitli kokular (video izleme üzerine) kaydedilir. Bu kokular toplam keşif kat daha fazla sudan daha az su çok kez bu "caydırıcı" denir, "çekici" olarak belirlenmiş. Araştırmacı sonra aynı kokuları farklı denekler için "çekici" veya "caydırıcı" olmadığını düşünmektedir.
Koku Hassasiyet Test Bölümü birincil araştırmacı 1-3 adımları takip edin.
Kör Araştırmacı
Koku tercih test prosedürü, 2 ve 4. adımları hafif değişiklikler ile aynıdır. Aşağıdaki değişiklikleri, kör bir araştırmacı için Koku Hassasiyet Test Bölümü 1-15 adımları takip edin: 2. adım için, önceden seçilmiş kokular (hem çekici ve caydırıcı kokular bir kombinasyonu) kullanılarak, her uygun sulandırılmış çözümler konik tüpler. Fıstık ezmesi gibi hidrofobik örnekleri için, çözücü olarak yağ kullanmak; tüm diğerleri için, distile su kullanın. Vorteks. Adım 4 için, test edilmesi seyreltme kayıt yerine, çalışmaların amacıyla rastgele, çeşitli kokular test edilecektir sırasını kaydeder.
Bu test, yani belirli algılama eksiklikleri, çekici ya da caydırıcı kokular anlamda yeteneği belirlemek için tasarlanmıştır. Aşağıdaki yordam Kobayakawa, K. ve ark protokol bolca ödünç 3. Yine, iki araştırmacı bir konu genotipler ve / veya durum kör, test dahil edilmelidir. Toplam keşif süre sonra tekrar çeşitli kokular (video izleme üzerine) kaydedilir. Toplam keşif kat daha fazla sudan daha az su çok kez bu "caydırıcı" denir bu kokular, "çekici" olarak belirlenmiş. Araştırmacı sonra aynı kokuları farklı denekler için "çekici" veya "caydırıcı" olmadığını düşünmektedir.
Koku Hassasiyet Test Bölümü birincil araştırmacı 1-3 adımları takip edin.
Kör Araştırmacı
Koku tercih test prosedürü, 2, 4 ve 13. adımları hafif değişiklikler ile aynıdır. Aşağıdaki değişiklikleri, kör bir araştırmacı için Koku Hassasiyet Test Bölümü 1-15 adımları takip edin: 2. adım için, önceden seçilmiş kokular (hem çekici ve caydırıcı kokular bir kombinasyonu) kullanılarak, her uygun sulandırılmış çözümler konik tüpler. Fıstık ezmesi gibi hidrofobik örnekleri için, çözücü olarak yağ kullanmak; tüm diğerleri için, distile su kullanın. Vorteks. 4. adımı, test edilmesi seyreltme kayıt yerine, her deneme amacıyla rastgele, test edilecek çeşitli kokular sırasını kaydeder. 13 adım için, hayvan mevcut konumunu ucunu kafes sonraki kokusu ile filtre kağıdı kare yerleştirin.
Şekil 3. Koku alma tercih test oturumu için Temsilcisi Her fare filtre kağıdı üzerinde farklı kokular her biri üç dakikalık seans için maruz oldu. Toplam süre filtre kağıdı değerlendirildi keşfetmek geçirdi. Fıstık ezmesi ve vanilya çekici kokular (keşif zaman kokusu> keşif zaman su) ve 2-Methylbutyric Asit (keşif zaman kokusu <keşif zaman su) caydırıcı.
Koku testleri Puanlama
Koku hassasiyeti ve tercih videoları oturduktan sonra, her seyreltme / koku keşfetmek harcanan toplam süre analiz etmek gereklidir. Kör araştırmacı tutarlılığı için tüm videoları analiz var.
- Vid önizlemeeo, aşağıdaki not: fare filtre kağıdı inceler ve d) üç dakika geçtikten a), filtre kağıdı arenada yerleştirilir, b) fare filtre kağıdı, c yaklaştığında) (filtre kağıt) arenada yerleştirildi. Fare davranış odaklanmak zaman bilmek, doğru bir inceleme sonucunda keşfetmek harcanan toplam süre daha kolay puan yapar.
- Video gözden geçirin. Fareyi ilk filtre kağıdı (gecikme) inceler zaman unutmayın.
- Tüm araştırmalar arenada filtre kağıdı yerleştirerek üç dakika içinde bir kronometre, zaman kullanma. Soruşturma zaman fare burun filtre kağıdı <1 mm herhangi bir zaman olarak tanımlanır. Fare filtre kağıdı yakın zaman önemlidir, ama aktif olarak soruşturma değil. Toplam keşif zaman kağıt üzerinde oturan kağıt veya nöbetleri çiğneme ve yalama nöbetleri dahil etmeyin. Koku alma davranışını doğru analiz etmek için yakından ve sürekli olarak bu kurallara uymak için gereklidir.
- Kayıt gecikme süresi, toplam süre filtre kağıdı ve video dosya numarası soruşturma geçirdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Söz konusu testler hızlı ve güvenilir bir temel koku fonksiyonunun değerlendirilmesi için izin verir. Bu güvenilirliğini test etmek için kişilerin doğru seçimi ve hazırlık gerektirir, ancak göz ardı edilecek değildir. Hasta ya da başka sakat hayvanların çoğu zaman tutarsız denekler. Ayrıca, denekler alışkanlık anahtarı. Alışma süreci sırasında, birden fazla kafesleri kullanımı, hayvanların deneyci işleme ve çevresi değişen rahat olmak için izin verdiğini bulduk. Ayrıca alışkanlık için belirtilen oranla daha kısa sürelerde anksiyete azaltmak için yeterli olmadığını buldular. Endişeli hayvanlar da genellikle öngörülemeyen denekler ve gerçek farklılıklar gizlenebilir.
Fareler gerçek bir test, veri toplamanın sadece tutarlı olması, aynı zamanda deneklerin davranışlarını analiz önemlidir. Biz test konu burnu toplam keşif süresi bir parçası olarak filtre kağıdı <1 mm olduğunda yararlıdır ancak o zaman saymak için bulduk. Ayrıca, filtre kağıdı çiğneme ya da ısırma gibi davranışlar toplam keşif süresi dahil değildir. Buna ek olarak, gecikme süresi (çekici kokular) da yararlı bir metrik olabilir. Farklı farelerin arka planlar, deney ve kontrol grubu arasında etkili bir ayrımcılık için farklı kokular dilüsyonları gerekebilir. Ayrıca, cinsiyet maç ve yaş maç çiftleri için önemlidir. Biz ampirik naif farelerde deneysel testleri ile devam etmeden önce uygun koku dilüsyonları (kontrol grubu ile benzer konularda) elde etmek için yararlı bulundu. Son olarak, bu testlerin, diğer herhangi bir bilişsel en önemlisi bozuklukları, öğrenme ve / veya bellek hatalarına etkisini en aza indirmek için seçildi. Bu amaçla, bu test için naif fareleri kullanmak için kritik öneme sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Finansman: Bu çalışma, Stuart HQ & Victoria Quan predoctoral Bursu (RMW), NIH Pioneer Ödülü (RAS) tarafından desteklenen
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutyric acid | Reagent | Sigma-Aldrich | W269506 | Concentrations Used:9.16 x 10-1 – 10-8 M (in H20) |
| Pure Vanilla Extract | Reagent | McCormick & Co. | n/a | Concentrations Used:10-1 – 10-5 dilution (in H20) |
| Peanut Butter (Skippy, Extra Crunchy) | Reagent | Unilever | n/a | Concentrations Used:10% (w/v), in mineral oil |
| Cinnamon Extract | Reagent | McCormick & Co. | n/a | Concentrations Used:10-1 – 10-5 dilution (in H20) |
| Mineral Oil, light | Reagent | Fisher Scientific | O121-1 | Concentrations Used:N/A |
References
- Crawley, J. N. What’s Wrong with my Mouse? Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice. , John Wiley and Sons. 42-60 (2007).
- Irwin, S. Comprehensive observational assessment: Ia. A systematic, quantitative procedure for assessing the behavioral and physiologic state of the mouse. Psychopharmacologia. 13, 222-257 (1968).
- Kobayakawa, K. Innate versus learned odour processing in the mouse olfactory bulb. Nature. 450, 503-508 (2007).
