Summary
Deze video toont ganse berg immunohistochemie, een methode waarmee de ruimtelijke en temporele expressiepatroon van een antigeen kan worden gevisualiseerd in jonge kippenembryo's. Deze methode werd oorspronkelijk geïntroduceerd door Jane Dodd en Tom Jessell.
Abstract
Het kuiken embryo is een waardevol instrument in de studie van de vroege embryonale ontwikkeling. De transparantie, toegankelijkheid en het gemak van manipulatie, maken het een ideale tool voor het bestuderen antilichaam uitdrukking in de ontwikkeling van de hersenen, neurale buis en somiet. Deze video toont de verschillende stappen in zijn geheel-mount antilichaam kleuring met behulp van HRP geconjugeerde secundaire antilichamen, de eerste plaats, het embryo wordt ontleed door het ei en gefixeerd in paraformaldehyde. Ten tweede, endogene peroxidase wordt geïnactiveerd; Het embryo wordt vervolgens blootgesteld aan primaire antilichaam. Na een aantal wasbeurten, is het embryo geïncubeerd met secundair antilichaam geconjugeerd aan HRP. Peroxidase-activiteit wordt onthuld met behulp van reactie met diaminobenzidine substraat. Tot slot wordt het embryo vast en verwerkt voor fotografie en snijden. Het voordeel van deze methode boven het gebruik van fluorescerende antilichamen is dat embryo's kunnen worden verwerkt voor het snijden was, waardoor de studie van antigeen sites in doorsnede. Deze methode werd oorspronkelijk geïntroduceerd door Jane Dodd en Tom Jessell
Protocol
I. Schematisch overzicht:
Deze video toont de verschillende stappen in het ganse berg immunohistochemie in kippenembryo. Eerst wordt het embryo vastgesteld in PFA [IHC1]. Vervolgens wordt de endogene peroxidase activiteit uitgeblust [IHC2]. Het embryo wordt vervolgens geïncubeerd in primaire antilichaam [IHC3]. Na een aantal wasbeurten, het embryo wordt geïncubeerd in secundaire antilichaam [IHC4]; Kleur reactie wordt geopenbaard via DAB [IHC5] en antilichaam vlekken lijkt oranje [IHC6].
Deel 1: Het bevestigen van de embryo's
- Voor het uitvoeren van ganse berg immunohistochemie op kippenembryo's, opent u eerst een ei door te tikken op de schaal met een tang en het verwijderen van delen van de schelp.
- Verwijder de dikke albumine met een tang, en kantel de dooierzak met grof tang, zodat de embryo naar boven wijst.
- Met behulp van fijne schaar, knip een vierkant van dooierzak rond het embryo. Verwijder het embryo uit de dooier met een lepel, en plaats in een schotel met PBS.
- Onder een microscoop dissectie, verwijder voorzichtig de membranen en de dooier en de embryo transfer naar een nieuwe schotel met PBS.
- Pin het embryo naar beneden met een tang en insecten pinnen, en zuig het PBS. Vervang deze met 4% PFA in PBS, en laat het embryo tot 1u vast te stellen op RT.
Deel 2: Voorbereiding van embryo's voor antilichaam stap
- Te minimaliseren mogelijke bacteriële besmetting, het gebruik DDH 2 O in alle volgende stappen.
- Nadat het embryo is vastgesteld, zuigen het fixeermiddel oplossing en afvoeren goed als chemisch afval. Vul de schotel met PBS.
- volgende, met behulp van een microdissectie mes, snijd een vierkant rond embryo tot extra-embryonale membranen te verwijderen. Verwijder insect pinnen met een pincet.
- Na het pinnen zijn verwijderd, gebruik dan een stomp uiteinde Pasteur pipet om de embryo transfer naar een scintillatieflesje die naast PBT (PBS pH 7,4, 0,5% Triton X).
- Was de embryo met PBT, 3 keer voor 10 minuten elk.
- Verwijder PBT uit de scintillatieflesje, en te vervangen door PBTx met 0,3% H 2 O 2 om potentiële endogene peroxidase inactiveren.
- Incubeer 2 uur bij RT op nutator.
- Was embryo met PBT, 3 keer voor 10 minuten elk, dan 3 keer voor 30 minuten elk.
Deel 3: Antibody incubatie
- Om vlekken op de embryo met antilichaam, begin dan met het wassen van de embryo's gedurende een uur in het blokkeren van buffer of 1% BSA / 1% NGS / PBT (we gebruiken NGS, omdat het secundaire antilichaam wordt verhoogd bij geiten). Incubeer op nutator gedurende een uur bij RT.
- Verdun het primaire antilichaam 01u01 in het blokkeren buffer, en incubeer embryo in deze oplossing gedurende 2 dagen bij 4 ° C op nutator. Primaire antilichaam verdunningsfactor afhankelijk van de keuze van de primaire antilichaam. Hier gebruiken we een antilichaam van de Ontwikkelings Studies Hybridoma Bank, die wordt verstrekt als supernatent. We verdunnen 1:1 in het blokkeren van buffer.
- volgende, voert drie 10-minuten wast in PBT, gevolgd door 3 1-uur wast in PBT.
- Na het wassen, verdunnen het secundaire antilichaam 1:2500 in het blokkeren van buffer (in dit geval peroxidase geconjugeerd geit-anti-muis IgG (H + L), en incubeer embryo in deze oplossing O / N bij 4 ° C op nutator.
- Voer drie 10-minuten wast in PBT, gevolgd door 3 1-uur wast in PBT.
Deel 3: Kleur reactie
- De ontwikkeling van de kleurreactie van de gebrandschilderde embryo, voert u eerst twee 20-minuten wasbeurten in Tris buffer (100mm Tris HCl, pH 7,4).
- Ondertussen ontbinden DAB substraat (3,3 '-diaminobenzidine tetrahydrochloride) in Tris buffer bij 500μg/ml onder zuurkast, houd-oplossing in het donker, op het ijs.
- Verwijder de laatste Tris-buffer wassen van de flacon met embryo en te vervangen door 5 ml DAB-oplossing van stap 3.2. Te houden in het donker op nutator voor 20 minuten. Gooi Eppendorf tip in een emmer met 10% bleekmiddel oplossing om DAB saneren.
- Ondertussen bereiden een 0,3% aandelen H 2 O 2 in dH 2 O op het ijs.
- Voeg 50μl voorraad H 2 O 2 tot en met flesje met embryo's in DAB. Te houden in het donker. Na 1-2 minuten, monitor reactie onder de microscoop.
Deel 4: Embryo verwerking voor fotografie en histologie
- Bij de kleurreactie is voltooid, beschikken over DAB in bleekwater emmer. Vervangen met 5 ml leidingwater.
- Uitvoeren van twee 10-minuten wassingen in PBS.
- Te verwerken voor fotografie en wax snijden, drogen in een ethanol-serie (25%, 50%, 75% en 100%) gedurende 10 minuten elk.
- Vervang de ethanol met 0,5 - 1 ml cederhout olie (dit zal het embryo doorzichtig te maken). Proces voor fotografie in cederhout olie.
- Na de fotografie, terug naar embryo flacon en vervanging van de cederhout olie met 100% ethanol. Herhaal stap ethanol.
- Vervang ethanol met 5% Fast groene FCF in 100% ethanol, en incubeer gedurende 3 minuten (deze stap zal maken embryo's zichtbaar voor histologie). Vervang Snel groen FCF oplossing met 100% ethanol en proces voor histologie.
Representatieve resultaten:
In de voorbeelden hieronder wordt weergegeven, worden embryo's ontleed in fasen HH 10 (A), 12 (B) en 11 (C); Embryo's tonen uitdrukking van PAX 7 in de opkomende neurale Crestas ook in somieten en neurale buis (A, B); In (C), is notochord gelabeld met 15.3B9 (Niet-1) (Antilichamen verstrekt door Developmental Studies Hybridoma Bank).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze video toont de verschillende stappen bij het uitvoeren van whole-mount antilichaam kleuring in jonge kippenembryo's. Dit protocol wordt hoofdzakelijk gebruikt voor de ruimtelijke en temporele karakterisering van nieuwe antilichamen in kuiken 2,3, evenals voor het gebruik van bekende antigene markers om embryonale misvormingen na belediging 4 vast te stellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De monoklonale antilichamen (15.3B9, PAX7) ontwikkeld door (J. Dodd, TM Jessell en A. Kawakami) werden verkregen uit de Developmental Studies Hybridoma Bank ontwikkeld onder auspiciën van de NICHD en onderhouden door de Universiteit van Iowa, Afdeling Biologische Wetenschappen , Iowa. DP is ontvanger van Ruth Kirschstein Award 1F32-01A1 DA021977 van het National Institute on Drug Abuse. Dit werk werd ondersteund door de Margaret M. Alkek Stichting RHF.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Charles River Laboratories | Premium Fertile | Fertilized, HH4 (16 hr) | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Marsh Automatic Incubator | Other | Lyon | RX | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Tool | Fine Science Tools | 11002-13 | |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon BD | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Microdissecting knife | Tool | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to cut embryo from surrounding membranes following fixation |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| 16% PFA | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 30% H2O2 | Reagent | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| BSA | Reagent | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| NGS | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Primary Antibodies | Reagent | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4G11, 15.3B9, PAX7 | For these antibodies, investgators used mouse donnors |
| Peroxidase conjugated-Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | |
| 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Reagent | Pierce, Thermo Scientific | 34001 | Store at -20; Allow bottle to warm to RT before use. |
| Cedar wood oil | Reagent | Sigma-Aldrich | W522503 | |
| Fast green FCF | Reagent | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Minuten pins 0.2mm diam | Fine Science Tools | 26002-20 |
References
- Yamada, T., Placzek, M., Tanaka, H., Dodd, J., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the developing nervous system: Polarizing activity of the floor plate and notochord. Cell. 64, 635-647 (1991).
- Streit, A., Stern, C. D., Thery, C., Ireland, G. W., Aparicio, S., Sharpe, M. J., Gherardi, E. A role for HGF/SF in neural induction and its expression in Hensen's node during gastrulation. Development. 121, 813-824 (1995).
- Basch, M., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. Specification of neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
