Summary
यह वीडियो पूरी माउंट immunohistochemistry, एक विधि है जिसके द्वारा एक प्रतिजन के स्थानिक और लौकिक अभिव्यक्ति पैटर्न जवान लड़की भ्रूण में visualized किया जा सकता है दर्शाता है. इस पद्धति का मूल रूप से जेन डोड और टॉम Jessell द्वारा पेश किया गया था.
Abstract
लड़की भ्रूण जल्दी भ्रूण के विकास के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण उपकरण है. इसकी पारदर्शिता, पहुंच, और हेरफेर की आसानी, यह मस्तिष्क, न्यूरल ट्यूब और somite विकास में एंटीबॉडी की अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श उपकरण बनाते हैं. यह वीडियो पूरी माउंट एंटीबॉडी एचआरपी संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग कर धुंधला में विभिन्न चरणों को दर्शाता है, पहला, भ्रूण अंडे से dissected है और paraformaldehyde में तय है. दूसरा, अंतर्जात peroxidase निष्क्रिय है, भ्रूण तो प्राथमिक एंटीबॉडी के संपर्क में है. कई washes के बाद, भ्रूण माध्यमिक एचआरपी को संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ incubated है. Peroxidase की गतिविधि diaminobenzidine सब्सट्रेट के साथ प्रतिक्रिया का उपयोग करने के लिए पता चला है. अंत में, भ्रूण तय है और फोटोग्राफी और सेक्शनिंग के लिए कार्रवाई की जाती है. फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के उपयोग पर इस विधि का लाभ यह है कि भ्रूण मोम सेक्शनिंग के लिए संसाधित किया जा सकता है, इस प्रकार सक्षम पार अनुभाग में प्रतिजन साइटों का अध्ययन. इस पद्धति का मूल रूप से जेन डोड और टॉम Jessell द्वारा शुरू की गई थी
Protocol
मैं योजनाबद्ध अवलोकन:
इस वीडियो लड़की भ्रूण में पूरे माउंट immunohistochemistry में विभिन्न चरणों को दर्शाता है. सबसे पहले, भ्रूण पीएफए में तय हो गई है [IHC1] फिर, अंतर्जात peroxidase गतिविधि बुझती है [IHC2] भ्रूण तो प्राथमिक एंटीबॉडी [IHC3] में incubated है. कई washes के बाद, भ्रूण माध्यमिक एंटीबॉडी में incubated है [IHC4], रंग प्रतिक्रिया थपका [IHC5] का उपयोग कर पता चला है और एंटीबॉडी धुंधला दिखाई देता है नारंगी [IHC6].
भाग 1: भ्रूण फिक्सिंग
- लड़की भ्रूण पर पूरे माउंट immunohistochemistry प्रदर्शन करने के लिए, पहले संदंश के साथ खोल दोहन और खोल के टुकड़े को हटाने के द्वारा एक अंडा खुला.
- संदंश के साथ मोटी albumin निकालें, और मोटे संदंश के साथ जर्दी थैली झुकाव इतना है कि भ्रूण ऊपर की तरफ चेहरे.
- ठीक कैंची का प्रयोग, जर्दी थैली भ्रूण के आसपास के एक वर्ग में कटौती. एक चम्मच के साथ जर्दी से भ्रूण निकालें, और पीबीएस युक्त पकवान में जगह.
- एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, ध्यान झिल्ली और जर्दी और भ्रूण एक ताजा पीबीएस युक्त डिश के लिए स्थानांतरण को हटा दें.
- भ्रूण पिन नीचे संदंश और कीट पिन के साथ, और PBS aspirate. पीएफए पीबीएस में 4% के साथ इस बदलें, और भ्रूण आरटी 1 तय करने के लिए अनुमति देते हैं.
भाग 2: एंटीबॉडी कदम के लिए तैयारी भ्रूण
- कम से कम संभावित माइक्रोबियल संदूषण के लिए, निम्नलिखित सभी चरणों में DDH 2 हे का उपयोग करें.
- भ्रूण के बाद तय हो गई है, लगानेवाला समाधान aspirate और रासायनिक अपशिष्ट के रूप में ठीक तरह से व्यवस्थित. पीबीएस के साथ पकवान भरें.
- अगले, एक microdissection चाकू का इस्तेमाल, भ्रूण के चारों ओर एक वर्ग कटौती extraembryonic झिल्ली को हटा दें. संदंश के साथ कीट पिन निकालें.
- बाद पिन को हटा दिया गया है, एक कुंद अंत पाश्चर विंदुक का उपयोग करने के लिए एक जगमगाहट पीबीटी (पीबीएस पीएच 7.4, 0.5% ट्राइटन एक्स) के साथ युक्त शीशी भ्रूण स्थानांतरण.
- पीबीटी साथ भ्रूण धो, 10 मिनट प्रत्येक के लिए 3 बार.
- जगमगाहट शीशी से पीबीटी निकालें, और PBTx 0.3% एच 2 हे 2 युक्त क्रम में अंतर्जात peroxidase निष्क्रिय करने की क्षमता के साथ बदलें .
- Nutator आरटी पर 2 घंटा के लिए सेते हैं.
- पीबीटी, 10 मिनट प्रत्येक के लिए 3 बार, तो प्रत्येक 30 मिनट के लिए 3 बार के साथ भ्रूण धो लें.
भाग 3: एंटीबॉडी ऊष्मायन
- एंटीबॉडी के साथ भ्रूण दाग के लिए, एक घंटे के लिए बफर अवरुद्ध या 1% BSA / 1% NGS / पीबीटी (हम NGS उपयोग क्योंकि माध्यमिक एंटीबॉडी बकरी में उठाया है) में भ्रूण धोने से शुरू करते हैं. आरटी में एक घंटे के लिए nutator पर सेते हैं.
- अवरुद्ध बफर, 4 में 2 दिन ° सी nutator पर के लिए इस समाधान में और सेते भ्रूण में प्राथमिक एंटीबॉडी 01:01 पतला. प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने कारक प्राथमिक एंटीबॉडी के चुनाव पर निर्भर करता है. यहाँ, हम विकासात्मक अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक, जो supernatent के रूप में प्रदान की जाती है से एक एंटीबॉडी का उपयोग करें. हम बफर को रोकने में इसे 01:01 पतला.
- अगले, पीबीटी में 3 10 मिनट washes, पीबीटी में 3 1 घंटे washes के द्वारा पीछा करते हैं.
- धोने के बाद, अवरुद्ध बफर में माध्यमिक एंटीबॉडी 1:2500 पतला (इस मामले में बकरी - संयुग्मित peroxidase विरोधी माउस (एच एल +) आईजीजी, और इस समाधान में सेते भ्रूण / 4 पर हे एन ° पर सी nutator.
- पीबीटी में 3 10 मिनट washes, पीबीटी में 3 1 घंटे washes के द्वारा पीछा किया प्रदर्शन करना.
भाग 3: रंग प्रतिक्रिया
- दाग भ्रूण का रंग प्रतिक्रिया विकसित करने के लिए, पहले 2 Tris बफर (100mm Tris एचसीएल, पीएच 7.4) में 20 मिनट washes के प्रदर्शन.
- इस बीच 500μg/ml में बफर Tris में धूआं हुड के नीचे थपका सब्सट्रेट (3,3 tetrahydrochloride 'diaminobenzidine) भंग, अंधेरे में समाधान रखने बर्फ पर.
- शीशी युक्त भ्रूण से पिछले Tris बफर धोने निकालें और 3.2 कदम से 5ml थपका समाधान के साथ बदलें. 20 करोड़ के लिए nutator पर अंधेरे में रखें. बाल्टी में एक 10% ब्लीच समाधान युक्त क्रम में थपका शुद्ध करना Eppendorf टिप को फेंक.
- इस बीच एक 0.3% शेयर DH 2 हे एच 2 2 हे बर्फ पर तैयार करते हैं.
- थपका में भ्रूण युक्त शीशी को 50μl एच 2 हे 2 शेयर जोड़ें. अंधेरे में रखें. 1-2 मिनट के बाद, खुर्दबीन के नीचे प्रतिक्रिया की निगरानी.
भाग 4: फोटोग्राफी और ऊतक विज्ञान के लिए भ्रूण प्रसंस्करण
- जब रंग प्रतिक्रिया पूरा हो गया है, ब्लीच बाल्टी में थपका के निपटान. 5 मिलीलीटर पानी के नल के साथ बदलें.
- पीबीएस में 2 10 मिनट washes के प्रदर्शन.
- फोटोग्राफी और मोम सेक्शनिंग के लिए प्रक्रिया करने के लिए, 10 मिनट प्रत्येक के लिए एक श्रृंखला में इथेनॉल निर्जलीकरण (25%, 50%, 75% और 100%).
- 1 मिलीलीटर देवदार लकड़ी का तेल (इस भ्रूण पारभासी कर देगा) - 0.5 के साथ इथेनॉल बदलें. देवदारू की लकड़ी तेल में फोटोग्राफी के लिए प्रक्रिया.
- फोटोग्राफी के बाद, शीशी भ्रूण वापसी और देवदारू की लकड़ी के तेल की जगह 100% इथेनॉल के साथ. इथेनॉल कदम दोहराएँ.
- ई बदलें5% 100% इथेनॉल में फास्ट हरी FCF के साथ thanol, और 3 मिनट (इस कदम भ्रूण ऊतक विज्ञान के लिए दिखाई कर देगा) के लिए सेते हैं. 100% और ऊतक विज्ञान के लिए इथेनॉल प्रक्रिया के साथ फास्ट हरी FCF समाधान बदलें.
प्रतिनिधि परिणाम:
नीचे दिखाया गया उदाहरण में, भ्रूण चरणों एचएच 10 (ए), 12 (बी) और 11 (सी) में dissected हैं, भ्रूण उभरते तंत्रिका crestas में 7 शांति की अभिव्यक्ति दिखाने में अच्छी तरह के रूप में somites और न्यूरल ट्यूब (ए, बी) में; (सी), notochord 15.3B9 (1 नहीं) (एंटीबॉडी विकासात्मक अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक द्वारा प्रदान की) के साथ लेबल है.
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Discussion
इस वीडियो युवा लड़की भ्रूण में पूरे माउंट एंटीबॉडी धुंधला प्रदर्शन में विभिन्न चरणों को दर्शाता है. इस प्रोटोकॉल अनिवार्य रूप से 2,3 चूजा में उपन्यास एंटीबॉडी के स्थानिक और लौकिक लक्षण वर्णन के लिए प्रयोग किया जाता है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ज्ञात प्रतिजनी मार्कर का उपयोग करने के लिए 4 अपमान के बाद भ्रूण malformations निर्धारित के लिए.
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Acknowledgments
मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (PAX7 15.3B9) (जे डोड, टीएम Jessell और ए Kawakami) विकसित विकासात्मक अध्ययन हाइब्रिडोमा NICHD और आयोवा विश्वविद्यालय द्वारा बनाए रखा, जीव विज्ञान के विभाग के तत्वावधान में विकसित बैंक से प्राप्त किया गया , आयोवा. डीपी रुथ Kirschstein पुरस्कार DA021977 01A1-1F32 के नशीली दवाओं के सेवन पर राष्ट्रीय संस्थान से प्राप्तकर्ता है. यह काम मार्गरेट एम. Alkek RHF फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Charles River Laboratories | Premium Fertile | Fertilized, HH4 (16 hr) | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Marsh Automatic Incubator | Other | Lyon | RX | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Tool | Fine Science Tools | 11002-13 | |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon BD | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Microdissecting knife | Tool | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to cut embryo from surrounding membranes following fixation |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| 16% PFA | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 30% H2O2 | Reagent | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| BSA | Reagent | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| NGS | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Primary Antibodies | Reagent | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4G11, 15.3B9, PAX7 | For these antibodies, investgators used mouse donnors |
| Peroxidase conjugated-Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | |
| 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Reagent | Pierce, Thermo Scientific | 34001 | Store at -20; Allow bottle to warm to RT before use. |
| Cedar wood oil | Reagent | Sigma-Aldrich | W522503 | |
| Fast green FCF | Reagent | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Minuten pins 0.2mm diam | Fine Science Tools | 26002-20 |
References
- Yamada, T., Placzek, M., Tanaka, H., Dodd, J., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the developing nervous system: Polarizing activity of the floor plate and notochord. Cell. 64, 635-647 (1991).
- Streit, A., Stern, C. D., Thery, C., Ireland, G. W., Aparicio, S., Sharpe, M. J., Gherardi, E. A role for HGF/SF in neural induction and its expression in Hensen's node during gastrulation. Development. 121, 813-824 (1995).
- Basch, M., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. Specification of neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
