Pressure-Polieren Pipetten für verbesserte Patch-Clamp Recording

Summary

Dies ist eine Anleitung zum Ändern der Form von Glas-Mikropipetten. Insbesondere durch Anwendung von Wärme und Luftdruck der Verjüngung ist ohne Erhöhung des Bahnöffnung verbreitert, was zu niedrigeren Pipette Widerstand. Dies ist entscheidend für rauscharme Aufnahmen von kleinen Zellen zu erhalten, sondern ist in vielen Anwendungen.

Abstract

Pressure-Polieren ist ein Verfahren zur Formgebung Glaspipetten für Patch-Clamp-Aufzeichnung. Zunächst entwickelte diese Methode zur Herstellung von Pipetten geeignet für die Aufnahme von kleinen (<3 m) neuronalen Zellkörpern. Das Grundprinzip ist ähnlich wie Glasblasen und verbindet Luftdruck und Wärme, um die Form von Patch-Pipetten mit einem herkömmlichen Mikropipette puller vorbereitet zu ändern. Es kann zu sogenannten weichen (Natronkalk) und schwer (Borosilikatglas) Gläser aufgebracht werden. Generell Druck Polieren kann Pipette Widerstand um 25% zu reduzieren, ohne die Verringerung der Durchmesser der Spitze Öffnung (Goodman und Lockery, 2000). Es kann praktisch jede Art von Glas aufgetragen werden und erfordert nur die Hinzufügung eines Hochdruck-Ventil und Montage an einem microforge. Diese Technik ist wichtig für die Aufnahme von ultrakleinen Zellen (<5 m) und können auch zur Verbesserung Einkanal-Aufnahme durch die Minimierung Pipette Widerstand. Die stumpfe Form ist auch für perforierte-Patch-Clamp-Aufzeichnung nützlich, da diese Form der Spitze führt zu einer größeren Membran bleb für Perforation.

Protocol

Pulling Pipetten

Mit Hilfe eines Fadens puller wie Sutter P-97 Flaming / Brown Microelectrode Puller, ziehen eine Reihe von etwa 10-20 Pipetten.

1. Wählen Sie Ihr Glas. Wir verwenden Borosilikat (BF150-86 bis 10, OD = 1,5 mm, ID = 0,86 mm). Bewahren Sie das Glas vorsichtig damit es sauber und staubfrei bleibt.
2. Entwerfen Sie ein Ziehen Programm. Das primäre Ziel ist ein Bahnöffnung etwa die gewünschte Größe, die auf Anwendung abhängen. Sutter P-97 Pipette Cookbook ² ist eine hervorragende Referenz.
3. Beobachten Sie Ihre Pipetten unter dem Mikroskop auf Öffnungsdurchmesser und Glätte zu bestimmen. Discard rau, uneben oder unregelmäßig Tipps. Für Standard-Patch-Clamp-Aufnahme wird ein Bahnöffnung daß 2-4 um über die beste ist. Eine stumpfe Spitze führt zu Widerstand für den gleichen Öffnungsdurchmesser, was bevorzugt ist niedriger. Form und Größe kann beim Polieren geändert werden, siehe unten.

Druck Polieren Pipetten

1. Bringen Sie einen Pipettenhalter, um eine saubere, Druckluftleitung. Mit einem Regler, setzen Sie die Druckluftleitung Druck ~ 40 PSI. Schließen Sie die Druckluftleitung in ein 4-Wege-Steuerventil, mit denen die Pipettenhalter Druck ein-und ausgeschaltet werden. Schließen Sie einen Pipettenhalter an das Regelventil mit einer Länge von ⅛ in Tygon ®-Schlauch.
2. Verwenden Sie ein Poliertuch rig (microforge) mit einem Hochdruck-Pipettenhalter, ein Polier-Spule durch ein Fußpedal, ein Mikroskop mit einer niedrigen und hohen Vergrößerungen, lange Distanzen (im Idealfall, 10x und 100x) Luft Zielen ausgestattet gesteuert. Es ist wichtig, um der Lage sein, die Pipette Öffnen während das Protokoll zu beobachten.
3. Optional: Bestreichen Sie die Pipette mit einer hydrophoben Isolator Kapazität zu verringern und verbessern das Geräuschverhalten (siehe "Pulling Pipetten" für diese Technik).
4. Überprüfen Sie das Druckventil ist in der Aus-Stellung. Legen Sie eine Pipette in die Pipettenhalter und ziehen Sie die Montage auf handfest.
   
   Sicherheitshinweis: Wenn die Pipette ist eng in die Pipette Halter gehalten, den Luftdruck bewirkt, dass die Pipette aus dem Pipettenhalter ausgeworfen werden.
   
   
5. Platzieren Sie die Pipette und Halter in der microforge. Positionieren Sie den Pipettenhalter auf dem Mikroskoptisch so dass sowohl die Spitze und das Polieren Spule sichtbar sind niedrig (10x) Macht auf der microforge. Bringen Sie die Spitze ~ 75 Mikron aus dem Filament. Denken Sie daran, dass der Faden dehnt sich bei Erwärmung.
6. Wechseln Sie auf die hohe Leistung (100x) Ziel. Sowohl die Pipettenspitze und das Polieren Spule sollte im Fokus und in das Blickfeld sein. Wenn nicht, stellen Sie die Höhe der Polier Spule. (Die Pipette die Position kann nicht eingestellt werden). Die Pipettenspitze und Polieren Spule sollte nahe an der gegenüberliegenden Seite des Gesichtsfeldes. Vermeiden Sie die Spule zu der Pipettenspitze schließen, weil es zu erweitern wird, wie es erwärmt und stoßen Ihrer Pipette.
7. Drehen Sie das Ventil mit Druckluft in die Pipette direkt und Wärme der Pipettenspitze bis zum Kegel hinter der Spitze beginnt, nach außen Ballon.
8. Stop-Heizung vor der Spitze Ballons zu umfangreich. Experimentieren ist erforderlich, um die entsprechende Distanz, Wärme und Zeit für die gewünschte Form zu bestimmen.
9. Optional: Reduzieren Sie die Spitze Öffnungsdurchmesser durch Polieren der Spitze in Abwesenheit von Druck. Schritte 7 und 8 können zur Feinabstimmung sowohl die Form und die Abmessungen der Pipettenspitze wiederholt.
10. Schalten Sie den Druck und während wies die Pipettenspitze in eine sichere Richtung, entfernen Sie die Pipette und legen Sie sie in einem sauberen Aufbewahrungsbox, wo sie vor Staub geschützt werden.
    
    Sicherheitshinweis: Wenn der Luftdruck nicht ausgeschaltet ist, die Pipette aus dem Pipettenhalter beim Entfernen ausgeworfen werden.

Hinweise zu den microforge

Wir verwenden eine microforge von off-the-shelf handelsüblichen Teilen zusammengesetzt. (Sie können auch ein Druck-Polierset von wenigen Unternehmen, zB ALA Science, GlassWorx). Unabhängig von der microforge, ist es wichtig, Optik, die gut genug, um die Spitze Öffnung, die oft nur wenigen Mikrometern Durchmesser zu sehen sind, haben. Wir verwenden eine lange Arbeitsabstand 100x-Objektiv für diesen Zweck. Auch Mantel der Politur Spule mit hoher Schmelztemperatur Glas zur Minimierung der Hinterlegung verdampft Metall auf der Pipetten.

Teil 3: Erwartete Ergebnisse

Moderate Druck Polieren ist die Beständigkeit von einer Pipette, ohne eine spürbare Veränderung in Öffnungsdurchmesser zu reduzieren. Falls gewünscht, kann dieses Protokoll verwendet, um Pipetten mit sub-Mikrometer-Öffnungen und Widerstände zwischen 5-10 M zu machen.

Discussion

Wir hatten ursprünglich entwickelte diese Methode, um Pipetten nützlich für Patch-Clamp-Aufnahme von 2-3 um Neuronen in C. elegans ^1. Es ist in den Routineeinsatz im Labor Goodman. Wir Druck-polnisch-Pipetten nicht nur für die Aufnahme von kleinen C. elegans Neuronen, sondern auch für den Erhalt macropatch und Single-Channel-Aufnahmen von Ionenkanälen in Xenopus Oozyten exprimiert. Für eine gegebene Tipp-Öffnungsdurchmesser, produziert die stumpfe Form einer niedrigeren Widerstand Pipette. Untere Pipette Widerstand führt zu niedrigeren Vorwiderstand und unteren Rausch-Aufnahmen.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Glass Capillaries	Consumable	Sutter Instrument Co.	BF150-85-10 (or similar)	The method works with any type of capillary except those made from quartz. However, we recommend using capillaries with a filament.
Inverted Microscope	Microscope	Leica Microsystems	DM IL (or similar)	Any simple inverted microscope will do. However, it is essential to have sufficient magnification to see pipettes during polishing. We use a 100x metallurgical lens with a long working distance for this purpose.
Microforge Kit	Tool	ALA Science	CPM-2	Supplies polishing coil, controller and foot pedal.
Air pressure source	Tool	ALA Science	PR-60	Accessory for providing high pressure, includes a suitable valve. Alternatively, compressed air from the building can be used together with a filter/regulator (set to 40 PSI) and a 4-way valve (see below)
4-way valve	Tool	Cole-Parmer	A-98150-01	Fittings will be needed to couple valve to tubing
Pipette Holder with Luer Connector	Tool	World Precision Instruments, Inc.	MPH-6S20	Use a male luer-to-barb fitting to connect pipette holder to high-pressure tubing
Tygon® tubing	Tool	Cole-Parmer	06408-62	Use this tubing to connect pipette holder to 4-way valve