الضغط تلميع الماصات لتسجيل باتش تحسين المشبك

Summary

هذا هو دليل على تعديل شكل micropipettes الزجاج. على وجه التحديد ، وذلك باستخدام الحرارة والضغط الجوي وتوسيع تفتق دون زيادة افتتاح الطرف ، مما يؤدي إلى انخفاض المقاومة ماصة. هذا أمر بالغ الأهمية للحصول على تسجيلات ضوضاء منخفضة من خلايا صغيرة لكنها مفيدة في العديد من التطبيقات.

Abstract

الضغط التلميع وسيلة لتشكيل ماصات زجاجية للتسجيل التصحيح ، المشبك. نحن أول من طور هذه الطريقة لانتاج ماصات مناسبة للتسجيل من الصغيرة (<3 م) هيئات الخلية العصبية. الرئيسية الأساسية هي مشابهة لنفخ الزجاج ويجمع بين الضغط الجوي والحرارة لتعديل شكل ماصات التصحيح أعدها مجتذب micropipette التقليدية. ويمكن تطبيقه على ما يسمى لينة (صودا الجير) والثابت النظارات (البورسليكات). ويمكن عموما تلميع الضغط ، والحد من المقاومة ماصة بنسبة 25 ٪ ، دون التقليل من قطر لافتتاح غيض (غودمان وLockery ، 2000). ويمكن تطبيقه على أي نوع تقريبا من الزجاج ويتطلب سوى إضافة صمام الضغط العالي وتركيب لmicroforge. هذا الأسلوب هو ضروري لتسجيل من خلايا ultrasmall (<5 م) ويمكن أن تحسن أيضا على قناة واحدة تسجيل عن طريق تقليل مقاومة ماصة. الشكل السافر ما هو مفيد أيضا لتسجيل المشبك مثقوبة ، حيث أن هذه النتائج التصحيح شكل غيض في فقاعة أكبر ثقب غشاء متاح.

Protocol

سحب ماصات

باستخدام خيوط مجتذب مثل سوتر P - 97 يلهب / براون بولير Microelectrode ، سحب مجموعة من حوالي 10-20 الماصات.

1. حدد الزجاج الخاص. نستخدم البورسليكات (BF150 - 86 - 10 ، OD = 1.5 ملم ، ID = 0.86 ملم). مخزن الزجاج بعناية بحيث يبقى نظيفا والغبار الحرة.
2. تصميم برنامج الانسحاب. الهدف الأساسي هو غيض افتتاح تقريبا الحجم المطلوب ، والتي سوف تعتمد على التطبيق. سوتر في P - 97 كتاب الطبخ الماصة ² هو إشارة ممتازة.
3. مراقبة ماصات الخاص تحت المجهر لتحديد قطرها الافتتاح وسلاسة. تجاهل الخام ، نصائح متفاوتا ، أو غير منتظمة. لمعيار التصحيح تسجيل المشبك ، وهي غيض الافتتاحية التي 2-4 ميكرومتر عبر هو أفضل. وهناك معلومات غير حادة يؤدي إلى انخفاض المقاومة لفتح القطر نفسه ، الذي هو المفضل. يمكن تعديل الشكل والحجم خلال تلميع أدناه.

ماصات ضغط تلميع

1. نعلق حامل ماصة لتنظيف ، خط الهواء المضغوط. باستخدام المنظم ، تعيين خط ضغط الهواء المضغوط الى 40 PSI ~. توصيل خط الهواء المضغوط لصمام التحكم 4 - الطريقة التي سوف تسمح بإلغاء الضغط على حامل ماصة وخارجها. توصيل حامل ماصة للصمام التحكم بطول ⅛ في Tygon ® الأنابيب.
2. استخدام حفار تلميع (microforge) مع حامل ماصة ذات الضغط العالي ، لفائف تلميع يسيطر عليها دواسة القدم ، المجهر مجهزة التكبير المنخفضة والعالية ، لمسافات طويلة في العمل (من الناحية المثالية ، 10x و100X) أهداف الجوية. فمن الأهمية بمكان أن تكون قادرا على مراقبة افتتاح ماصة خلال البروتوكول.
3. اختياري : معطف ماصة مع عازل مسعور لتقليل السعة وتحسين خصائص الضوضاء (راجع "ماصات سحب" لهذا الأسلوب).
4. التحقق من صمام الضغط في موقف قبالة. مكان ماصة في حامل ماصة وتشديد المناسب لضيق الاصبع.
   
   علما سلامة : إذا تم عقد ماصة بإحكام في الحامل ماصة ، والضغط الجوي يؤدي إلى إخراج ماصة من حامل ماصة.
   
   
5. ضع ماصة وحامل في microforge. موقف حامل ماصة على خشبة المسرح المجهر حتى أن كلا من غيض وتلميع لفائف مرئية في السلطة (10X) منخفضة على microforge. إحضار غيض ~ 75 ميكرون من خيوط. نضع في اعتبارنا أن خيوط سوف توسع عند تسخينها.
6. التبديل إلى الهدف عالية (100X) السلطة. ينبغي لكل طرف وماصة لفائف تلميع يكون في التركيز وفي مجال الرؤية. إن لم يكن ، وضبط ارتفاع فائف التلميع. (لا يمكن ان موقف ماصة لتعديلها). ينبغي للطرف ماصة واللولب تلميع تكون قريبة من طرفي نقيض في مجال الرؤية. تجنب وضع لفائف قريبة جدا من طرف ماصة لأنها ستوسع لأنه مع ارتفاع درجات الحرارة وتصطدم ماصة الخاص.
7. بدوره صمام لتوجيه الهواء المضغوط في ماصة ، والحرارة غيض ماصة حتى تفتق راء تلميح يبدأ البالون الخارج.
8. توقف التدفئة قبل الطرف البالونات على نطاق واسع جدا. التجريب هو مطلوب لتحديد مسافة مناسبة ، والحرارة ، والوقت للشكل المطلوب.
9. اختياري : تقليل قطرها افتتاح غيض من قبل تلميع طرف في غياب الضغط. ويمكن تكرار الخطوات 7 و 8 لضبط كل من شكل وأبعاد غيض ماصة.
10. إيقاف الضغط وبينما تشير غيض ماصة في اتجاه آمنة وإزالة ماصة ووضعه في صندوق التخزين نظيفة حيث سيتم حمايتها من الغبار.
    
    علما سلامة : إذا لم يتم تشغيل ضغط الهواء خارج ، ويمكن إخراج ماصة من حامل ماصة أثناء الإزالة.

ملاحظات حول microforge

نستخدم microforge تجميعها من خارج الجرف الأجزاء المتاحة تجاريا. (يمكنك أيضا شراء مجموعة أدوات الضغط تلميع من عدد قليل من الشركات ، على سبيل المثال ، ALA العلوم ، GlassWorx). بغض النظر عن microforge ، فمن الضروري أن يكون البصريات التي هي جيدة بما يكفي لرؤية افتتاح الطرف ، التي غالبا ما تكون قليلة فقط ميكرون في القطر. نستخدم عدسة لمسافات طويلة في العمل 100X لهذا الغرض. أيضا ، معطف فائف تلميع الزجاج مع ارتفاع في درجة الحرارة ذوبان من أجل تقليل إيداع المعادن المتبخرة على ماصات.

الجزء 3 : النتائج المتوقعة

ويمكن خفض ضغط معتدل تلميع مقاومة ماصة بدون إحداث أي تغيير ملموس في فتح القطر. إذا رغبت في ذلك ، يمكن استخدام هذا البروتوكول مع ماصات لجعل شبه ميكرون الفتحات وبين المقاومات 10MΩ - 5.

Discussion

نحن وضعت أصلا لجعل هذه الطريقة مفيدة لماصات التصحيح ، المشبك تسجيل 2-3 ميكرومتر الخلايا العصبية في C. ايليجانس ^1. هو في الاستخدام الروتيني في المختبر غودمان. ماصات ضغط تلميع نحن ليس فقط لتسجيل صغيرة من C. ايليجانس الخلايا العصبية ، ولكن أيضا من أجل الحصول على macropatch والقناة واحدة من القنوات ايون التسجيلات التي أعرب عنها في القيطم البويضات. ليبلغ قطرها طرف فتح معينة ، شكل حادة تنتج أقل ماصة للمقاومة الفلسطينية. مقاومة أقل ماصة يؤدي إلى انخفاض المقاومة سلسلة والتسجيلات أقل ضوضاء.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Glass Capillaries	Consumable	Sutter Instrument Co.	BF150-85-10 (or similar)	The method works with any type of capillary except those made from quartz. However, we recommend using capillaries with a filament.
Inverted Microscope	Microscope	Leica Microsystems	DM IL (or similar)	Any simple inverted microscope will do. However, it is essential to have sufficient magnification to see pipettes during polishing. We use a 100x metallurgical lens with a long working distance for this purpose.
Microforge Kit	Tool	ALA Science	CPM-2	Supplies polishing coil, controller and foot pedal.
Air pressure source	Tool	ALA Science	PR-60	Accessory for providing high pressure, includes a suitable valve. Alternatively, compressed air from the building can be used together with a filter/regulator (set to 40 PSI) and a 4-way valve (see below)
4-way valve	Tool	Cole-Parmer	A-98150-01	Fittings will be needed to couple valve to tubing
Pipette Holder with Luer Connector	Tool	World Precision Instruments, Inc.	MPH-6S20	Use a male luer-to-barb fitting to connect pipette holder to high-pressure tubing
Tygon® tubing	Tool	Cole-Parmer	06408-62	Use this tubing to connect pipette holder to 4-way valve