Çevre Biliminde Aseptik Teknik

Aseptik teknik, mikrobiyolojide temel bir beceridir ve çevre araştırmalarında çok önemli uygulamalara sahiptir.

Mikrobiyolojik kültürler kontamine olursa, bir laboratuvarın kültürleri, özellikle de benzersiz ortamlardan gelen nadir izolatları "temizlemek" veya değiştirmek için gerekli olan zaman, işçilik ve finansal maliyetler çok yüksek ve engelleyici olabilir ve bazı numunelerin yeri doldurulamaz olabilir.

Aseptik tekniklerin doğru kullanımı, reaktiflerin, kültür ortamlarının ve çevresel numunelerin bakteriyel ve fungal kontaminasyon olasılığını azaltır ve ayrıca numuneler arasında çapraz kontaminasyonu önler. Aynı zamanda, mikropların deneyciye potansiyel bulaşmasını azaltan bir güvenlik önlemidir ve bu, patojenlerle çalışırken özellikle önemlidir.

Bu videoda asepsi prensipleri tanıtılacaktır; steril reaktifleri ve kültürleri korumak için birkaç önemli teknik; ve son olarak, çevre bilimindeki kullanımlarından bazıları.

Aseptik tekniklerin kullanılmasının amacı, biyolojik numunelerin kontaminasyonunu en aza indirmek için steril bir çalışma ortamı, ekipman ve reaktifler oluşturmak ve sürdürmektir. Yaygın kontaminasyon kaynakları arasında havadaki mikroorganizmalar, laboratuvar tezgahında veya ekipmanında bulunan mikroplar ve araştırmacının saçından, vücudundan ve giysilerinden gelenler bulunur.

Laboratuvarda kontaminasyonun giderilmesi veya önlenmesi için iki tür ajan merkezi öneme sahiptir: dezenfektan, kimyasallar ve ısı. Aseptik çalışmaya başlamadan önce ekipmanı, çalışma yüzeylerini ve deneycilerin eldivenlerini dezenfekte etmek için genellikle %70 etanol ve seyreltik ağartıcı gibi çözeltiler kullanılır.

Aynı zamanda, aletler, cam eşyalar ve sıvı ortamlar üzerindeki veya içindeki mikroplar, yüksek sıcaklıkta basınçlı buhara maruz kalarak içeriği sterilize eden bir oda olan bir otoklavda ısıyla öldürülebilir. Ek olarak, yayılmış kaplama için kullanılan cam çubuklar ve metal aşılama halkaları gibi aletler, Bunsen brülörü gibi bir alev kaynağı kullanılarak ısıyla sterilize edilebilir.

Bir alev kaynağının kullanılması aynı zamanda aseptik bir çalışma ortamı oluşturmanın en yaygın yollarından biridir. Alevden gelen ısı, hava konveksiyonuna neden olur, havadaki kirleticileri brülörün çevresinden uzaklaştıran bir yukarı hava akımı oluşturur ve aseptik deneysel çalışmaların yürütülmesi için "steril bir alan" oluşturur.

Artık aseptik tekniklerin arkasındaki ilkeleri ve neden önemli olduklarını anladığınıza göre, aseptik bir çalışma ortamı oluşturmak, steril büyüme ortamı oluşturmak ve bakterileri farklı kültür koşulları arasında aseptik olarak aktarmak için bir protokol gözden geçirelim.

Aseptik çalışmaya başlamadan önce, deneycinin uygun kişisel koruyucu ekipman veya KKD giymesi önemlidir. Bunun amacı hem deneycinin numuneleri ve laboratuvar kültürlerini kontamine etmesini önlemek, hem de potansiyel olarak patojenik mikropların araştırmacıya transferini önlemektir. KKD ürünleri arasında laboratuvar önlüğü, eldiven ve koruyucu gözlük bulunur.

Bir sonraki adım, mikrobiyal numunelerin kültürlenmesi için kullanılacak büyüme ortamının uygun şekilde sterilize edilmesi ve saklanmasıdır. İlk olarak, uygun miktarda katı ortam bileşenini tartın ve bunları, otoklavlanabilir bir kapta deiyonize su gibi üretici tarafından belirtilen uygun hacimde sıvı çözücüye ekleyin, Manyetik bir karıştırma çubuğu ekleyin, kabı bir sıcak plaka karıştırıcı üzerine yerleştirin ve katı ortam bileşenlerini düşük ısı ve karıştırma ile çözün.

Orta boy kapları kapatın. Vidalı kapaklı bir cam kap kullanıyorsanız, kapların içindeki hava otoklavlama sırasında ısınma nedeniyle genişleyeceğinden ve dışarı çıkması gerektiğinden, kapağı tamamen sıkmadığınızdan emin olun. Kaçış olmadan, gaz geminin yırtılmasına neden olabilir. Kapların üzerine bir parça otoklav bandı koyun ve ortamı üreticinin talimatlarına göre, örneğin 121 ° C'de 20 dakika gibi otoklavlayın. Otoklavlamadan sonra, otoklav bantları üzerindeki şeritlerin siyaha döndüğünü ve uygun sıcaklığa ulaşıldığını gösterdiğini doğrulayın.

Sıvı büyüme ortamları için, oda sıcaklığına soğumaya bırakın ve uygun şekilde oda sıcaklığında veya buzdolabında saklayın. Agar bazlı katı büyüme ortamı için, yaklaşık 50 ° C'ye kadar soğumalarını bekleyin. C, daha sonra steril Petri kaplarına dökün. Uygun sıcaklıkta saklamadan önce agarın soğumasını ve katılaşmasını bekleyin.

Isıya duyarlı bileşenlerin varlığı nedeniyle otoklavlanamayan ortamlar için, filtre 0,22 μm'lik bir filtre kullanılarak sterilize edilir.

Mikrobiyolojik çalışmalarda temel bir teknik, bakteri kültürlerini hem katı hem de sıvı olmak üzere farklı büyüme ortamları arasında aseptik olarak transfer etmektir. Başlamadan önce laboratuvar tezgahı yüzeyini bir dezenfektanla temizleyin. Bu, kültürlerin veya steril ortamların kontamine olma riskini azaltır.

Bakteri kültürlerinin aktarılması genellikle, kullanımdan önce bir alevde ısıtılarak sterilize edilmesi gereken aşılama halkası adı verilen bir alet kullanır.

Bir alev kaynağını açın. Aşılama halkasını alevin ucundan yavaşça geçirin. Döngü kırmızıya dönecektir. Bir bakteri kolonisini katı bir agar plakasından aktarmak için, Petri plakasını hafifçe açın ve bakterilerin ısıyla öldürmesini önlemek için sıcak aşılama halkasını agar yüzeyinin boş bir kısmına hafifçe vurun. Aşılama halkası ile tek bir koloniyi kazıyın ve plakayı kapatın.

Bakterileri sıvı bir büyüme ortamından aktarmak için, kapağı kültür kabından çıkarın. Kontaminasyonu önlemeye yardımcı olmak için, kapağı tezgahın üzerine koymaktan kaçının. Kabın ağzını 2-3 kez alevin en sıcak kısmından geçirin. Ardından, sıcak, sterilize edilmiş aşılama halkasını kabın içine dikkatlice dokundurun ve et suyu kültürüne yerleştirmeden önce soğumasını bekleyin. Kültürün bir ilmeğini çıkarın ve hemen kapağı kapatın.

Elde edilen bakterileri steril bir büyüme ortamına aktarmak için, steril et suyu ile bir kaptan kapağı çıkarın ve kabın ağzını 2-3 kez alevden geçirin. Ardından, aşılama halkasını dikkatlice ortama indirin ve bakterileri serbest bırakmak için hafifçe çalkalayın. Hemen kapağı kapatın. Kullandıktan sonra aşılama döngüsünü sterilize edin.

Bakterileri steril bir agar plakasına aktarıyorsanız, aşılanmamış agar içeren taze bir Petri plakasının kapağını açın. Bakteri kültürü ile aşılama döngüsünü, agarın bir sektörü boyunca ileri geri hareket ettirin. İlmeği sterilize edin ve agarın boş bir kısmına dokunarak soğutun, ardından agar üzerinde ilk çizgiye geniş bir açıyla başka bir çizgi yapın, ilk 1-2 vuruşta ilk çizgiyi geçtiğinizden emin olun, ancak sonraki vuruşlarda ilk çizgiye dokunmaktan kaçının. Sterilizasyonu ve çizgiyi 2 kez daha tekrarlayın. Petri plakasını kapatın ve aşılama döngüsünü sterilize edin.

Aşılandıktan sonra, et suyu veya agar plakası daha sonra canlı kültür elde etmek için verilen mikroorganizma için ideal büyüme sıcaklığında inkübe edilmelidir. Katı ortamda, ilk iki çizginin kapladığı agar üzerinde bir çim veya sürekli bakteri ipliği görülebilir, ancak son çizgide bireysel koloniler elde edilmelidir. Kötü aseptik teknikler, plaka üzerinde küf ve diğer kirleticilerin büyümesine neden olur.

Aseptik teknikler, çevreden alınan mikrobiyal numuneleri içeren birçok deneyde önemlidir. Bu çalışmada araştırmacılar, bakterileri enfekte eden virüsler olan bakteriyofajları, yaygın toprak bakterisi Arthrobacter'den izole ettiler. Arthrobacter kültürleri ilk olarak aseptik koşullar altında büyütüldü. Toprak örnekleri daha sonra faj tamponunda yıkandı ve süzüldü ve faj çözeltisi bakteri kültürü ile karıştırıldı ve agar plakaları üzerine kaplandı. Plaka üzerinde bir bakteri çimi oluşacaktı, ancak virüsün bakterileri enfekte ettiği ve öldürdüğü noktalarda açıklıklar veya "plaklar" olacaktı. Faj daha sonra daha fazla çalışma için bu plaklardan saflaştırılabilir.

Bunsen brülörlerinin kullanılmasının yanı sıra, aseptik çalışma ortamları, steriliteyi korumak için yönlendirilmiş hava akışı ve filtreler kullanan laminer akış davlumbazları olarak bilinen özel iş istasyonlarında da korunabilir. Burada bilim adamları, potansiyel patojenik bakteri ve virüsleri su örneklerinden izole etmek için bir akış başlığında çalıştılar. Bu izolatlar daha sonra amiplerle birlikte kültürlendi. Amipler normalde bakterileri yedikleri veya "fagositoz" ettikleri için, amip sindirimine direnebilen ve bu organizmalarda kalabilen herhangi bir bakteri de insan hücrelerinde potansiyel olarak canlı kalabilir ve hastalıklara neden olabilir.

Son olarak, steril koşullar, baklagil bitkilerinde kök nodüllerinin oluşumu gibi ekolojik mekanizmaların ayrıntılı çalışmasına izin verir - atmosferik nitrojeni bitki tarafından büyüme için kullanılan amonyağa "sabitleyen" bakteri dolu organlar. Buradaki araştırmacılar, bitki büyüme ortamı ile çentikli Petri plakaları kullanarak nodülasyon sürecini incelemek için "mikrokozmoslar" oluşturdular, bunlara fideleri yerleştirdiler ve fideleri nodül oluşturan rizobiyal bakterilerle aşıladılar. Akış davlumbazının aseptik ortamı, kültürlerin diğer bakteri veya mantarlarla kontaminasyonunu önler.

Az önce JoVE'nin çevre bilimindeki aseptik teknikler hakkındaki videosunu izlediniz. Artık aseptik çalışma koşullarının neden önemli olduğunu anlamalısınız; mikrobiyolojik deneylerin aseptik olarak nasıl yapılacağı; ve aseptik tekniklerin çevre araştırmalarına bazı uygulamaları. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!