Plazmit Saflaştırma

Plazmitler dairesel, ekstra kromozomal DNA molekülleridir ve moleküler biyolojide belirli bir DNA fragmanı için taşıyıcılar veya vektörler olarak görev yaparlar. İlgi duyulan DNA'nın seri üretimi için plazmitleri çoğaltmak amacıyla bakteriler kullanılır. Araştırmacıların bakterilerden plazmit elde etme sürecine plazmit saflaştırma denir ve bu işlem bu videoda açıklanacaktır.

Açıkçası, plazmit saflaştırma plazmitlerin saflaştırılmasını içerir, peki bu tam olarak ne anlama gelir? Plazmitleri saflaştırmak için bunların bakteriyel kromozomdan, proteinlerden, bakteri membranından ve bakteriyel ribozomlardan izole edilmesi gerekir.

Plazmitleri saflaştırmak için birçok farklı kit mevcut olsa da, plazmit saflaştırmasının temel prensibi tümü için aynı kalır. İlk olarak, seçilen bakteriyel koloni, uygun antibiyotikleri içeren uygun bir kültür ortamında büyütülür. Plazmit tarafından kodlanan bir antibiyotik direnç geni sayesinde, bu ortamda yalnızca plazmit içeren bakteriler büyür. Bakteriler hasat edilir ve yüksek pH altında lizlenir. pH nötralize edilir, tuz eklenir ve ardından kalıntıları ve genomik DNA'yı uzaklaştırmak için karışım santrifüj edilir.

Nötralize edilmiş hücre lizatı bir silika kolona eklenir. Plazmit DNA'nın, güçlü bir anyon olan DNA'nın katyon tuz köprüsü aracılığıyla negatif yüklü kolona bağlandığı anyon değişimi adı verilen bir mekanizma ile kolona tutunduğuna inanılmaktadır. Proteinler gibi lizattan gelen diğer materyaller, yüksek tuzlu tamponlarla kolon boyunca yıkanarak uzaklaştırılır. Son olarak, tuz köprüsünü bozan düşük tuzlu bir tampon eklendiğinde, saflaştırılmış plazmit kolondan serbest bırakılır.

Bu prosedür için laboratuvar önlüğü, tek kullanımlık eldivenler ve koruyucu gözlükler giyilmelidir.

İstenen plazmit DNA ile transforme edilmiş olan bakteri kültürleri, 37°C'lik çalkalamalı inkübatörde uygun antibiyotikli büyüme ortamında gece boyunca büyütülmelidir.

Ertesi gün, bakteri kültürü santrifüjle peletlenir ve süpernatan uzaklaştırılır. Kalan pelet, lizis tamponunda yeniden süspanse edilir.

Yeniden süspanse edildikten sonra, bakteriler lizis tamponunun eklendiği daha küçük bir tüpe aktarılabilir. Lizis tamponu yüksek pH'lıdır ve bakteri membranlarını parçalayarak bakterileri lize eden sodyum dodesil sülfat gibi deterjanlar içerir. Lizis tamponu eklendiğinde çözelti bulanıklaşacak ve karıştırıldıktan sonra çözelti daha berrak hale gelecektir. Genomik DNA'nın kırılma veya parçalanma olasılığı nedeniyle karışım vorteksle karıştırılmamalıdır, aksi takdirde plazmit DNA saflaştırması kontamine olabilir.

Ardından, alkali koşulları nötralize etmek ve pH'ı düşürmek için nötralizasyon tamponu eklenir. Nazikçe karıştırma ile genomik DNA ve ona bağlı proteinler çökerken, plazmit DNA çözeltide kalır. Plazmitlerinizin genomik DNA kontaminasyonundan arındırılmış olması için tekrar vorteksle karıştırmaktan kaçının.

Karışım daha sonra santrifüj edilir ve genomik DNA/protein çökeltisi peletlenir. Süpernatan, plazmit DNA'nın yanı sıra çözünür proteinleri içerir.

Bu süpernatan, dekantasyon (dökerek aktarma) veya pipetleme yoluyla kolona yerleştirilir. Pelet atılabilir.

Ardından, DNA silikaya bağlı kalırken yüksek tuzlu yıkama tamponu kolondan geçirilir. Yüksek tuzlu tamponla tekrarlanan yıkama basamakları; endonükleazları, RNA'yı, proteinleri, boyaları ve düşük moleküler ağırlıklı safsızlıkları uzaklaştırır. Yıkama basamaklarının akış çözeltisi atılmalıdır. Son yıkama basamağından sonra, filtrenin hiç tampon kalmadan tamamen kuru olduğundan emin olun. Plazmit DNA hâlâ filtre üzerinde bulunmaktadır.

Plazmit DNA, steril su veya bir elüsyon tamponu ile elüye edilir. DNA, geniş bir uygulama yelpazesinde anında kullanım için hazır hale gelir.

Saflaştırma sonrası plazmitlerin saflığını doğrulamanın birçok yolu vardır. Plazmit DNA konsantrasyonunu belirlemek için farklı dalga boylarındaki absorbansı karşılaştırmak amacıyla bir spektrometre kullanılabilir. Saflaştırılmış plazmitin agaroz jel analizi, plazmitin doğru boyutta olup olmadığını ve kontaminasyon olup olmadığını belirleyebilir. Bu adım, genomik DNA kontaminasyonu olmadığını ve plazmitin bakterilerde modifiye edilmediğini sağlar.

Plazmid saflaştırma prosedürü; farklı plazmid boyutlarına, kopya sayısına ve kültür hacmine uyum sağlayacak şekilde modifiye edilebilir; ayrıca bağlanma, yıkama ve elüsyon adımları için farklı ekipmanlar içerebilir. Verim, plazmid preparasyonları arasındaki en belirgin farklardan biridir ve bunlar genellikle istenen verime bağlı olarak minipreparasyon (veya miniprep), midiprep, maxiprep ve megaprep olarak ayrılırlar.

Alt uygulamalar açısından, plazmid saflaştırmasını yaygın olarak takip eden prosedürlerden biri, plazmid DNA'nın ökaryotik hücrelere aktarılmasını içeren transfeksiyondur. Bir transfeksiyon deneyinin amacı genellikle, burada gördüğünüz görüntülerdeki nöronları işaretleyenler gibi reporter proteinler aracılığıyla hücrelerin ve dokuların yapısını görselleştirmektir.

Bazen, çeşitli saflaştırma preparasyonları ile saflaştırılmış birden fazla plazmid aynı bakteriye aktarılabilir; böylece plazmidler tarafından kodlanan bir dizi enzimin üretimi yoluyla tüm bir biyosentetik yol yeniden oluşturulabilir. Nihai sonuç, hücre tarafından burada gördüğünüz antibiyotik gibi karmaşık bir bileşiğin üretilmesidir.

Saflaştırılmış plazmidler, plazmid tarafından kodlanan yüksek miktarda protein üretmek amacıyla bakterilere yeniden aktarılabilir. Burada, hedef proteini izole etmek için afinite saflaştırması adı verilen bir teknik uygulanmadan önce bakteriyel hücrelerin homojenize edildiğini ve liz edildiğini görüyorsunuz. Saflaştırılmış protein kristalleştirilir ve ardından yapısı belirlenir.

JoVE'nin plazmit saflaştırma konusundaki giriş videosunu izlediniz. Bu videoda, bu yöntemin temel prensiplerini, adım adım açıklamasını ve plazmit hazırlığınızın bazı uygulama alanlarını ele aldık. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!