Tüm Maymun Beyin Büyük Ölçekli Protein Algılama için Toplu immün

Bu prosedür, çevreleyen matrise gömülü hizalama yer işaretleri kullanılarak gömülmek üzere Neuroscience ortaklarına gönderilen %4 PFA perfüze, dışsallaştırılmış ve kriyo korumalı bir beynin alınmasıyla başlar. Beyin, özel sepetler ve kaplar kullanılarak beynin tüm ön arka uzantısını temsil edecek olan istenen kalınlıkta seri kesitler üretmek için koronal düzlemde bölümlere ayrılabilir. Toplu immüno-işleme, bir proteinin tüm beyin boyunca uzamsal ekspresyon modelini belirlemek için gerçekleştirilebilir.

Merhaba, ben Montreal Üniversitesi Optometri Okulu'ndaki Görsel Sinirbilim Laboratuvarı'ndan Dr.Shaheen Zur. Merhaba, ben Dr.Mark Burke, aynı zamanda Montreal Üniversitesi Optometri Okulu'ndaki Görsel Sinirbilim Laboratuvarı'ndanım. Merhaba, ben Montreal Üniversitesi Optometri Okulu'nda Görsel Sinirbilim Laboratuvarı direktörü olan Dr.Mo Petto.

Bugün size bütün bir maymun beyninde büyük ölçekli protein tespiti için toplu immün boyama prosedürü göstereceğiz. Laboratuvarımızda, tüm beyindeki hedef proteinlerin ekspresyon modellerini incelemek ve bu proteinlerin aynı beyindeki ekspresyonunu karşılaştırmak ve karşılaştırmak için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Histolojik işlemden önce, sistemik perfüzyon ve post fiksasyon yoluyla korunmuş ve dereceli sükroz çözeltileri kullanılarak kriyo korumalı bir primat beyni elde edin. Bu aşamada beyin, tescilli teknolojileri kullanılarak gömülmek ve serbest bölümlere ayrılmak üzere sinirbilim ortaklarına gönderilir. Geri dönüldüğünde, histolojik işlem tamamlandıktan sonra bölümlerin düzgün bir şekilde yönlendirilebilmesi ve yeniden hizalanabilmesi için gömme matrisine yedi hizalama yer işaretinin yerleştirildiği görülecektir.

Kesitleme yapılırken, daha sonra anatomik haritaların 3 boyutlu rekonstrüksiyonu için kullanılabilecek dijital görüntüler alınır. Sinirbilimci, dokumuzu tüm beyin üzerinde 50 mikrometre kalınlığında seri serbest yüzen koronal bölümler oluşturacak şekilde işler. Tamamlandığında, bölümlerin histolojik işlemesine başlayabiliriz.

Histolojik işlemeye başladığımızda, tipik olarak antikor veya leke başına ele almamız gereken yaklaşık 140 bölümümüz olur. Burada tekniği, fosforile olmayan nörofilament proteinlere karşı monoklonal bir antikor olan SMI 32 antikoru ile muamele edilen daha küçük bir kesit örneği ile göstereceğiz. Prosedür boyunca, çok sayıda serbest yüzer bölümün aynı anda ve verimli bir şekilde işlenmesine izin veren özel boyama kapları ve sepetleri kullanılır.

Bu, ortaya çıkan lekenin tüm bölümlerde tutarlı olmasını sağlar. İlk adım, bölümleri TRITTON X 100 ve normal at serumu içeren PBS bazlı bir solüsyonda 60 dakika inkübe etmektir. Bu, arka plan lekelenmesine neden olan antikor moleküllerinin spesifik olmayan bağlanmasını azaltacaktır.

Daha sonra, bölümler gece boyunca inkübe edilir. Ertesi gün tritton X 100 ve normal at serumu ile takviye edilmiş PBS bazlı SMI 32 antikor çözeltisinde, bölümler yıkama solüsyonunda 10 dakikalık üç periyot boyunca yıkanır ve daha sonra oda sıcaklığında iki saat inkübe edilir. Triton X 100 ve normal at serumu içeren PBS bazlı biyotinile edilmiş Muse ikincil antikor çözeltisinde.

10 dakikalık üç ek yıkamadan sonra, bölümler oda sıcaklığında bir saat boyunca bir avadon biotin konjuge at turpu peroksidaz kompleksi çözeltisine yerleştirilir. Son olarak, başka bir yıkama setinden sonra, bölümler 10 dakika boyunca bir D amino benzin reaksiyonuna yerleştirilir ve bu da immünoreaktif nöronlar içinde kahverengi bir leke oluşturur. Reaksiyon daha sonra boyama sepetinin çıkarılması ve bölümlerin PBS'ye daldırılmasıyla durdurulur.

PBS bölümlerinde iki ila üç, beş dakikalık durulamalardan sonra, büyük bir Petri kabı ve çok yumuşak boya fırçaları kullanarak montaj işlemine başlamak için cam slaytlara ayrı ayrı monte edilmeye hazır hale gelir. Bölümler PBS tampon kabından kaldırılır ve jelatin kaplı cam slaytlara ayrı ayrı monte edilir. Numuneler daha sonra ertesi gün bir çeker ocakta gece boyunca kurumaya bırakılır.

Bölümler, montaj işleminden arta kalabilecek tuz kristallerini yıkamak için di deiyonize suya batırılarak durulanır. Slaytlar daha sonra kademeli etanol adımlarında kurutulur, ksilen içinde temizlenir ve kapak, montaj başına montaj ortamı ile kaydırılır. Bu aşamada, montaj ortamının sertleşmesini sağlamak için slaytlar yaklaşık bir hafta ila 10 gün arasında yatay konumda saklanmalıdır.

Bundan sonra, slaytlar bir slayt kutusunda saklanabilir veya mikroskopi ile görüntülemeye tabi tutulabilir. Bu yöntem, tüm bir maymun beyni boyunca ilgilenilen bir hedef proteinin tam bir ekspresyon profilini üretir. Burada, FMRP, yeni n ve SMI 32 ifadesinin anlık görüntüsünü sağlayan temsili koronal kesitleri gösteriyoruz.

Aynı maymun beyninde. Size az önce tüm beyinde ilgilenilen bir hedef protein için toplu immün boyamayı nasıl tamamlayacağınızı gösterdik. Bu prosedürü yaparken, tüm bölümlerin çeşitli solüsyonlarda inkübe edilirken hafif çalkalanmaya maruz kalmasını ve her zaman tamamen daldırılmış kalmasını sağlamak önemlidir.

Ek olarak, cam diseksiyonları monte ederken zaman ayırın ve dokunun bütünlüğüne zarar vermeden mümkün olduğunca çok sayıda kırışıklık ve kıvrımı giderin. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.