Tüm Maymun Beyin Büyük Ölçekli Protein Algılama için Toplu immün

Bu prosedür, çevreleyen matrise gömülü hizalama işaretçileri kullanılarak gömme işlemi yapılması için Neuroscience associates'e gönderilen; %4 PFA ile perfüze edilmiş, eksternalize edilmiş ve kriyoproteksiyonu sağlanmış bir beynin alınmasıyla başlar. Beyin, özel sepetler ve kaplar kullanılarak, beynin tüm anterior-posterior uzunluğunu temsil edecek şekilde, istenen kalınlıkta seri kesitler elde etmek amacıyla koronal plandan kesilebilir. Bir proteinin tüm beyindeki uzaysal ekspresyon paternini belirlemek için toplu immünoprosesleme işlemi gerçekleştirilebilir.

Merhaba, ben Montreal Üniversitesi Optometri Okulu'ndaki Görsel Nörobilimler Laboratuvarı'ndan Dr. Shaheen Zur. Merhaba, ben de Montreal Üniversitesi Optometri Okulu'ndaki Görsel Nörobilimler Laboratuvarı'ndan Dr. Mark Burke. Merhaba, ben Montreal Üniversitesi Optometri Okulu'ndaki Görsel Nörobilim Laboratuvarı'nın direktörü Dr. Mo Petto.

Bugün size, bütün bir maymun beyninde geniş ölçekli protein tespiti için kullanılan toplu immün boyama prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, hedef proteinlerin tüm beyindeki ekspresyon modellerini incelemek ve aynı beyin içindeki bu proteinlerin ekspresyonlarını karşılaştırıp kıyaslamak için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Histolojik işleme başlamadan önce; sistemik perfüzyon ile korunan, fiksasyon sonrası işlemden geçirilmiş ve dereceli sakkaroz çözeltileri kullanılarak kriyokoruma uygulanmış bir primat beyni temin edin. Bu aşamada beyin, gömme işlemi yapılması ve tescilli teknolojileri kullanılarak serbest kesitlerin alınması için nörobilim uzmanlarına gönderilir. Geri döndüğünde, kesitlerin uygun şekilde yönlendirilebilmesi ve histolojik işlem tamamlandıktan sonra yeniden hizalanabilmesi için gömme matrisine yedi adet hizalama işaretinin yerleştirildiği görülecektir.

Kesit alma işlemi gerçekleştirilirken, daha sonra anatomik haritaların 3B rekonstrüksiyonu için kullanılabilecek dijital görüntüler alınır. Sinirbilim uzmanı ortaklarımız, tüm beyin boyunca 50 µm kalınlığında seri, serbest yüzen koronal kesitler elde etmek için dokumuzu işler. Bu işlem tamamlandığında, kesitlerin histolojik işlemine başlayabiliriz.

Histolojik işleme başladığımızda, genellikle antikor veya boya başına işlenecek yaklaşık 140 kesitimiz olur. Burada tekniği, fosforile olmamış nörofilament proteinlerine karşı monoklonal bir antikor olan SMI 32 antikoru ile işlem görmüş daha küçük bir kesit örneği üzerinde göstereceğiz. Prosedür boyunca, çok sayıda serbest yüzen kesitin eş zamanlı ve verimli bir şekilde işlenmesine olanak tanıyan özel boyama kapları ve sepetleri kullanılır.

Bu, elde edilen boyamanın tüm kesitlerde tutarlı olmasını sağlar. İlk adım, kesitlerin TRITTON X 100 ve normal at serumu içeren PBS bazlı bir çözeltide 60 dakika boyunca inkübe edilmesidir. Bu işlem, arka plan boyanmasına neden olan antikor moleküllerinin spesifik olmayan bağlanmasını azaltacaktır.

Ardından, kesitler gece boyunca inkübe edilir. Ertesi gün kesitler, yıkama solüsyonu ile üç kez 10 dakikalık periyotlarla yıkandıktan sonra; Triton X 100 ve normal at serumu ile desteklenmiş, PBS bazlı biotinize Muse sekonder antikor solüsyonu içerisinde oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edilir. Bu işlem, Triton X 100 ve normal at serumu içeren PBS bazlı SMI 32 antikor solüsyonunda gerçekleştirilir.

Üç kez tekrarlanan 10 dakikalık ek yıkama işlemlerinin ardından kesitler, oda sıcaklığında bir saat boyunca avadon biotin konjugatlı yaban turpu peroksidaz kompleksi çözeltisine yerleştirilir. Son olarak, bir başka yıkama setinin ardından kesitler, immunoreaktif nöronlar içinde kahverengi bir boyama oluşturan D amino benzin reaksiyonuna 10 dakika boyunca bırakılır. Boyama sepetinin çıkarılması ve kesitlerin PBS içine daldırılmasıyla reaksiyon durdurulur.

PBS ile iki ila üç kez, beşer dakikalık durulama yapıldıktan sonra kesitler, büyük bir Petri kabı ve çok yumuşak resim fırçaları kullanılarak montaj işlemine başlanmak üzere cam lamlar üzerine tek tek yerleştirilmeye hazırdır. Kesitler PBS tampon çözelti kabından alınır ve jelatin kaplı cam lamlar üzerine tek tek monte edilir. Örneklerin ardından bir çeker ocak içerisinde gece boyunca havada kuruması sağlanır.

Montaj işleminden kalmış olabilecek tuz kristallerini temizlemek için kesitler, deiyonize suya daldırılarak durulanır. Ardından lamlar, dereceli etanol basamaklarıyla dehidre edilir, ksilen ile temizlenir ve per mount montaj medyumu ile kapatılır. Bu aşamada lamlar, montaj medyumunun sertleşmesine izin vermek için yaklaşık bir hafta ila 10 gün boyunca yatay konumda saklanmalıdır.

Bundan sonra lamlar, bir lam kutusunda saklanabilir veya mikroskopi yoluyla görüntülemeye tabi tutulabilir. Bu yöntem, hedef alınan bir proteinin tüm maymun beyni boyunca eksiksiz bir ekspresyon profilini oluşturur. Burada, FMRP, neuN ve SMI 32 ekspresyonunun anlık görüntüsünü sunan temsili koronal kesitleri gösteriyoruz.

Aynı maymun beyninde. Az önce, tüm beyin boyunca ilgilenilen bir hedef protein için toplu immün boyamanın nasıl tamamlanacağını gösterdik. Bu prosedür uygulanırken, tüm kesitlerin çeşitli çözeltilerde inkübe edilirken hafifçe çalkalandığından ve her an tamamen daldırılmış durumda kaldığından emin olmak önemlidir.

Ek olarak, diseksiyonları lam üzerine yerleştirirken acele etmeyin ve dokunun bütünlüğüne zarar vermeden mümkün olduğunca çok kırışıklığı ve katlanmayı giderin. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.