Name: Tüm Maymun Beyin Büyük Ölçekli Protein Algılama için Toplu immün (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Öğrenin, maymun beyninde büyük ölçekli protein algılama için toplu immün boyama yöntemini. Seri koronal kesitler ve özel sepetlerle tüm beyinde protein ifade desenlerini analiz edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Frank Ervin, Roberta Palmour ve primat çalışmaları devam eden desteği, Batı Hint Adaları, St Kitts bulunan Davranış Bilimleri Vakfı Laboratuar personeline teşekkür ediyoruz. Kanada Sağlık Araştırmaları (AC) ve Ulusal Mühendislik ve Kanada Araştırma Konseyi (MP) Enstitüleri işletme hibeleri - Bu çalışma Frajil X Araştırma SZ Kanada Vakfı (FXRFC) ve bir burs ile desteklenmiştir.

Immunohistochemisty çeşitli deneysel hayvan modellerinde beyin protein ifade tanımlamak için en yaygın olarak kullanılan tekniklerin biridir. Benzer beyin büyüklüğü ile kemirgenler ve diğer ortak deneysel modeller beyinlerinde sistematik immünohistokimyasal işlemleri yürütmek nispeten kolaydır. Ancak, bütün bir maymun beyin çapında İmmuno prosedürleri yürütmek için nasıl kapsamlı bir hesap sağlar bilgimizi yayınlanmış hiçbir çalışma yoktur. Aşağıda, çeşitli hedef proteinlerin büyük ölçekli immünohistokimyasal tespiti için bütün bir maymun beyni nasıl hazırlamak için ayrıntılı bir açıklama. Bu çalışma, ticari ve akademik çalışmaların arasındaki işbirliğinin bir sonucu olarak ortaya çıkmıştır. Gibi, doku gömme ve kesit ilgili detayları NSA, özel bir bilgi kalır. Bölüm 1: Hayvan tedavi ve doku hazırlanması İşbu Protokol, yetişkin bir vervet maymun (cebus aethiops) beynin kullanılır . Tüm işlemler, biyomedikal araştırma 1 hayvanlarının kullanımı ve bakımı için Hayvan Bakım Kanada Konseyi (CCAC) yönergeleri ile uyum içinde yürütülmektedir . <ol><li> Hayvan derinden aşırı dozda sodyum pentobarbital (25 mg / kg, iv) ve tamamen exsanguinated kadar 0.1 M PBS ile transcardially perfüze ötenazi ketamin hidroklorür (10 mg / kg, im) ile sedasyon. </li><li> Bu 5 dakika (~ 1 litre) PBS içinde% 4 paraformaldehid çözümü ile takip edilmektedir. </li><li> Dışsallaşmış beyin, beyin kabın dibine lavabolar ˚ C kadar% 0.02 sodyum azid içeren PBS-tamponlu kademeli sakaroz çözümleri (sırayla 10, 20 ve% 30) yerleştirilir ve 4 tutulur. Beyin donma-kesit uğrar kadar çözüm birkaç günde değiştirilir. </li><li> Tescilli MultiBrain tabi ™ gömme ve donma-kesit teknolojisi, beyin Neuroscience Associates (Knoxville NSA) gönderilir. </li><li> Yedi (7) hizalama işaretlerini bölümleri doğru yönde (örneğin, sağ-sol yönlendirme) ve histolojik işlem tamamlandıktan sonra yeniden hizalanmış böylece gömme matris yerleştirilir. </li><li> Dondurulmuş blok, her blok seri bölümünde toplanan önce dijital blok yüzüne fotoğraflandı. Dijital görüntülerin yanı sıra, bu beyin bölümlerinin daha sonra sırasıyla, anatomik ve histolojik haritaları 3 boyutlu rekonstrüksiyon için kullanılan olabilir. </li><li> Seri serbest koronal bölümleri, bölüm başına 50 mikron kalınlığında, tüm beyin toplanır. </li></ol> Bölüm 2: Histolojik işleme Bölüm belirli bir mekansal aralıklarla seçilir (örneğin, 500 mikron) ve deneysel amaçlar için aşağıdaki antikorlar ile işlendi: kırılgan-X mental retardasyon protein (FMRP; Chemicon; Temecula, CA), SMI32 (Sternberger Monoclonals A.Ş.; Baltimore, MD) ve Neun (Chemicon; Temecula, CA). FMRP, bol miktarda normal ve permütasyon taşıyıcı beyinleri nöronlar 2 bulunan bir sitoplazmik bir proteindir. Neun (Nöronal Çekirdekler) özellikle en nöronlarda ve nöron çekirdekleri, perikarya ve proksimal bazı nöronal süreçleri 3 dağıtılır nöron spesifik DNA-bağlayıcı protein Neun tanır. SMI-32 nörofilaman proteinler 4 olmayan fosforile epitop tanıyan bir monoklonal antikor. <ol><li> 500 mikron aralığında yaklaşık 140 bölümleri antikor başına kullanılır. </li><li> Tüm inkubasyon, yıkama ve boyama adımları hafif ajitasyon özel boyama yemekleri ve sepetler (Knoxville, TN HistoTools) kullanılarak yapılmaktadır. </li><li> Bölüm ilk antikor moleküllerinin nonspesifik bağlayıcı ve arka plan boyama azaltmak için 0.1 M PBS/0.3% Triton X-100 (TX) / 60 dakika süreyle% 5 normal boğuk serum (NHS) içeren bir çözüm inkübe edilir. </li><li> Üreticisinin talimatlarına göre; immün FMRP işaretli bölümleri Antijen açığa çıkarılması Çözümü (Burlingame, CA Vektör Labs) kullanarak antijen kurtarma ek bir adım uğrarlar. </li><li> Bölüm sonra geceleme ve 0.1 M PBS/0.3% TX /% 3 NHS (Neun antikorlar FMRP ve SMI-32 ve 1 / 2, 000 1 / 5, 000 bir sulandırma faktörü içeren, ilgili antikor çözümler ayrı gün inkübe edilir. </li><li> 1 /; ertesi gün, bölümler üç yıkama solüsyonu oda sıcaklığında 2 saat atı gündeme biotinlenmiş anti-fare sekonder antikoru (Vektör Labs inkübasyon takip 10 dakikalık bir süre (0,1 M PBS/0.3% TX) yıkanır 0,1 M PBS/0.3% TX / 3% NHS 1000 dilüsyon). </li><li> 3 10 dakika yıkar daha da ayarladıktan sonra, oda sıcaklığında 1 saat süreyle avidin-biotin konjuge horseradish peroksidaz kompleksi (Vektör Labs) bir çözüm bölümleri yerleştirilir. </li><li> Son olarak, başka bir ayarladıktan sonra yıkar, bölümler nikel gelişmiş dia 10 dakika tabi tutulurminobenzidine (Ni-DAB) immunoreaktif nöronların içinde koyu mavi bir leke üretir tepki. </li><li> Histolojik prosedür bitiminde, bölümler, jelatin kaplı cam slaytlar monte edilmiştir. </li><li> Tüm bölümler, hava kuru bir gecede ve standart prosedürlere göre dakika muamele. </li></ol> Bölüm 3: Temsilcisi Sonuçlar: Bu yöntem, bütün bir maymun beyin çapında ilgi bir hedef protein tam bir ifade profili üretir. Burada FMRP, Neun ve aynı maymun beyni ifade SMI32 bir anlık sağlamak temsilcisi koronal bölümleri göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/1286/1286fig1.png" alt="" /> Şekil 1: Boyama çanak (A) ve sepet (B) İmmuno için serbest bölümden büyük ölçekli toplu işlem için kullanılır. <img src="/files/ftp_upload/1286/1286fig2.png" alt="" /> Şekil 2: FMRP (A), Neun (B) ve SMI32 (C) antikorları ile boyanan bir vervet maymun beyin Temsilcisi koronal kesitler.

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+to+the+Care+and+Use+of+Experimental+Animals%22">Guide to the Care and Use of Experimental Animals</a>. Olfert, E. D., Cross, B. M., McWilliam, A. A. , Canadian Council on Animal Care. Ottawa. (1993).</li>
<li>Devys, D., Lutz, Y., Rouyer, N., Bellocq, J. P., Mandel, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FMR-1+protein+is+cytoplasmic%2C+most+abundant+in+neurons+and+appears+normal+in+carriers+of+a+fragile+X+premutation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The FMR-1 protein is cytoplasmic, most abundant in neurons and appears normal in carriers of a fragile X premutation.</a> Nat Genet. 4, 335-340 (1993).</li>
<li>Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuN%2C+a+neuronal+specific+nuclear+protein+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates.</a> Development. 116, 201-211 (1992).</li>
<li>Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+distinguish+phosphorylated+and+nonphosphorylated+forms+of+neurofilaments+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80, 6126-6130 (1983).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Mümkün bütün bir maymun beyin proteinlerin büyük ölçekli algılama yapan bu yordamı iki kritik adımlar vardır. Bir NSA özel bilgi kalır gömme ve kesit protokolü. Diğer HistoTools tarafından sağlanan boyama yemekleri ve sepetler. Ikincisi, belirli bir zamanda çok sayıda (~ 40) bölümleri kolay ve hızlı kullanım sağlar. Aynı zamanda beyin genelinde tüm bölümleri düzgün tedavi için gerekli olan araçları sağlar ve bilimsel bir ses histolojik tedavi için yapar. Buna ek olarak, gömülü yerlerinden kullanılması, kurutulmuş ve dak...

<table><tbody><tr><td>anti-FMRP monoklonal antikor</td><td>Chemicon International</td><td>MAB2160</td><td>Fikse edilmiş dokuda antijen geri kazanımı gerektirir.</td></tr><tr><td>anti-NeuN monoklonal antikor</td><td>Chemicon International</td><td>MAB377</td><td>Y/A</td></tr><tr><td>anti-Neurofilament H monoklonal antikor</td><td>Sternberger Monoclonals Inc.</td><td>SMI32</td><td>Y/A</td></tr><tr><td>Antijen Maske Açma Solüsyonu</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-3300</td><td>Y/A</td></tr><tr><td>Normal at serumu</td><td>Invitrogen</td><td>16050122</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Biyotinize Anti-Fare IgG (H+L), at kaynaklı</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-2000</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABC Kiti (Standart)</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-4000</td><td>1.5 mg</td></tr><tr><td>Yüzen kesitler için boyama kabı</td><td>HistoTools</td><td>10009</td><td>12 x 65 mm</td></tr><tr><td>Boyama taşıma sepeti</td><td>HistoTools</td><td>10012</td><td>büyük&lt;br/&gt;(12 x 65 mm kaba uygundur)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>P8514B</td><td>Y/A</td></tr><tr><td>DAB</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC11209-0050</td><td>Y/A</td></tr></tbody></table>

tüm maymun beyin büyük Ölçekli protein algılama için toplu immün

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immünhistokimyasal (İHK) hedef proteinlerin tespiti için en yaygın kullanılan laboratuvar teknikleri biridir<em&gt; In situ</em&gt;. Tüm beyin çapında bir hedef protein ifade deseni ile ilgili sorular, kemirgen gibi küçük beyinleri, İHK kullanırken cevap nispeten kolay. Ancak, primatlar gibi büyük ve karışık beyinleri, aynı soruları yanıtlarken, zorluklarla dolu bir dizi. Burada bir yetişkin maymun beyni hedef proteinlerin İmmuno için sistematik bir yaklaşım sunuyoruz. Bu yaklaşım, doku gömme ve kesit Neuroscience Associates metodolojisi (NSA) yanı sıra serbest bölümleri toplu boyama için özel olarak geliştirilen araçlar dayanmaktadır. Belirli bir aralıkta, tüm beyni temsil eder, bir dizi bölümleri düzgün boyama ile sonuçlanır. Sonucu lekeli bölümleri protein düzeyleri, belirli bir protein ifade nöronların nüfus ölçmek için analitik yöntemler çok çeşitli tabi tutulabilir.

Tüm primat beyin genelinde hedef proteinlere büyük ölçekli İmmuno gömerek yeni doku istihdam ve belirli bir zamanda birden fazla serbest bölümleri toplu boyama için yaratıcı cihazların kullanımı ile kombine yöntemler kesit mümkündür.

Tüm Maymun Beyin Büyük Ölçekli Protein Algılama için Toplu immün

İmmünohistokimya (IHC), hedef proteinlerin in situ tespitinde en yaygın kullanılan laboratuvar tekniklerinden biridir. ... ile ilgili sorular

Bu prosedür, çevreleyen matrise gömülü hizalama işaretçileri kullanılarak gömme işlemi yapılması için Neuroscience associates'e gönderilen; %4 PFA ile perfüze edilmiş, eksternalize edilmiş ve kriyoproteksiyonu sağlanmış bir beynin alınmasıyla başlar. Beyin, özel sepetler ve kaplar kullanılarak, beynin tüm anterior-posterior uzunluğunu temsil edecek şekilde, istenen kalınlıkta seri kesitler elde etmek amacıyla koronal plandan kesilebilir. Bir proteinin tüm beyindeki uzaysal ekspresyon paternini belirlemek için toplu immünoprosesleme işlemi gerçekleştirilebilir.Merhaba, ben Montreal Üniversitesi Optometri Okulu'ndaki Görsel Nörobilimler Laboratuvarı'ndan Dr. Shaheen Zur. Merhaba, ben de Montreal Üniversitesi Optometri Okulu'ndaki Görsel Nörobilimler Laboratuvarı'ndan Dr. Mark Burke. Merhaba, ben Montreal Üniversitesi Optometri Okulu'ndaki Görsel Nörobilim Laboratuvarı'nın direktörü Dr. Mo Petto.Bugün size, bütün bir maymun beyninde geniş ölçekli protein tespiti için kullanılan toplu immün boyama prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, hedef proteinlerin tüm beyindeki ekspresyon modellerini incelemek ve aynı beyin içindeki bu proteinlerin ekspresyonlarını karşılaştır

batch-immunostaining-for-large-scale-protein-detection-whole-monkey

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Beyin bankacılık ve biyolojik materyalin sistematik örnekleme tarafsız stereology temelini sağlar ve olası veri her numune elde edilen en üst düzeye çıkarır.

Beyin Bankacılık: Araştırma Örneklerinin En iyi şekilde

Biz, kemirgenler ve insan olmayan primatlardan farklı yaşlarda beyin dilimleri nöron gibi DII floresan boyalar, tanıtmak için, gen tabancasının kullanımını göstermektedir. Bu özel durumda, yetişkin farelerin (3-6 ay) ve yetişkin cynomologus maymunlar (9-15 yaşında) kullanın. Dr Lichtman laboratuvar tarafından açıklanan bu teknik,...

Kemirgen Nöronlar ve Sigara insan Primate Beyin Slices DiOLISTIC Etiketleme

Nöral devreler topografik spesifik moleküler profilleri ile fonksiyonel bölme halinde düzenlenmiştir. Burada, çok yönlü bir wholemount immünohistokimyasal yaklaşımını kullanarak global beyin topoğrafya ortaya çıkarılması için pratik ve teknik adımları sağlar. Bu iyi anlaşılmış cytoarchitecture ve beyincik devre kullanarak yöntemin yardımcı göstermektedir.

Revealing Kompleksi Beyin Topografya Wholemount İmmünohistokimya

Kaynak: Schönherr, S., et. al. Fare Amigdalasındaki Glutamat Reseptörlerinin Girişe Özgü Düzenlemesini İncelemek için Kombine Optogenetik ve Donma Kırığı Replika İmmün Etiketleme. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, elektron mikroskobu için fare beyin dokusunun donarak kırılmış kopyalarının immüno-etiketlemesini göstermektedir. Kırılmış ve kaplanmış kopyalar, reseptörleri açığa çıkarmak için sindirilir. Primer ve altın etiketli sekonder antikorlar, spesifik nöronal membran reseptörlerini etiketlemek...

Fare Beyin Dokusunun Donarak Kırılmış Bir Örneğinde Nöronal Membran Proteinlerinin İmmünoetiketlenmesi

Kaynak: Eid, L. &amp; Parent, M. İmmünohistokimya ve Elektron Mikroskobu için İnsan Olmayan Primat Beyin Dokusunun Hazırlanması. J. Vis. Uzm. (2017). Bu video, elektron mikroskobu için önceden gömme immünohistokimya kullanılarak aldehitle sabitlenmiş insan olmayan primat beyin dokusunun hazırlanmasını göstermektedir. Spesifik bir nöronal proteinin immüno-etiketleme adımlarını ana hatlarıyla belirtir, ardından renkli bir çökelti üreten bir peroksidaz reaksiyonu ile hedef proteinin elektron...

İnsan Dışı Primat Beyin Dokusunda İmmünohistokimya Yapılması

Bu giriş seviyesi protokolü, örnek olarak mikroglia ve nöronal elementler için belirteçler kullanarak, kemirgen beyinlerinin immünohistokimyasal boyamasını tamamlamak için gereken reaktifleri, ekipmanı ve teknikleri açıklar.

Mikroglia ve nöronlar için örnek Boyama: Cryosectioned Rat Beyin Dokusu Üzerine İmmünohistokimya için Astar

Burada, kolay ve düşük maliyetli sağlar ve zaman tasarrufu sağlayan bir protokol kimyasal transmisyon elektron mikroskobu için immünohistokimya ön gömme uyumlu uzun süreli koruma sağlayan, akrolein sabitleyici ile primat beyin dokusunun düzeltmek için.

İmmünohistokimya ve elektron mikroskobu Ön gömme için İnsan Olmayan Primat Beyin Dokusu Hazırlanması

Bu protokol, mikroglial yoğunluk, dağılım ve morfolojinin yanı sıra fare beyin dokusunda periferik miyeloid hücre infiltrasyonunun analizine ek olarak, IBA1 ve TMEM119'un immünororesan costaining'i için adım adım iş akışını tanımlar.

Fare Beyninde Mikroglial Yoğunluk, Morfoloji ve Periferik Miyeloid Hücre Infiltrasyonu Analizi için IBA1 ve TMEM119 Kullanılarak İmmünofloresanS Boyama

Bu protokol, perfüzyon, beyin kesiti, serbest yüzen immünostaining, doku montajı ve görüntüleme dahil olmak üzere fare beyni histolojik çalışmaları için verimli ve tekrarlanabilir bir yaklaşımı açıklar.

Fare Beyinlerinin Serbest Yüzen İmmünasyon

Seri iki fotonlu tomografi (STPT) görüntüleme, iki fotonlu görüntülemeyi otomatik evre kontrolü ve mikrotom dilimleme ile birleştirerek bir doku kütlesini üç boyutlu şeklinde görüntülemek için kullanılan bir tekniktir. Burada, marmoset beyinlerinin yapısal özelliklerini daha iyi anlamaları için bunu uygulamak için bir protokol açıklıyoruz.

Nöroanatomik Analizler için Tüm Marmoset Beyninin Seri İki Fotonlu Tomografisi

Modern sinirbilimler, laboratuvar kemirgenleri ve insanlar dahil olmak üzere birçok tür arasındaki farkları keşfetmelidir. Ancak büyük beyinli memeliler söz konusu olduğunda teknik zorluklar ortaya çıkar. Bu yaklaşım, çok farklı memelilerde nöronal popülasyonların türler arası varyasyonlarını ele alır ve evrimsel kalıpların ortaya çıkarılması için haritalanacak benzer sonuçlar sunar.

Farklı Memeli Beyinlerinde Nicel Hücre Sayımı Çalışmaları İçin Karşılaştırmalı Yaklaşım

Öğrenin, maymun beyninde büyük ölçekli protein algılama için toplu immün boyama yöntemini. Seri koronal kesitler ve özel sepetlerle tüm beyinde protein ifade desenlerini analiz edin.

Tüm Maymun Beyin Büyük Ölçekli Protein Algılama için Toplu immün

Daha fazla video keşfet