Name: Terminal Farklılaşma incelenmesi için hazırlanması ve Rat Lens Epitel eksplantlar Kültür (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 2 s
Description: Öğrenin, yeni doğan sıçan lens epitel eksplantlarını FGF-2 ile kültüre ederek terminal farklılaşma sürecini nasıl inceleyeceğinizi. İmmünofloresan mikroskopi ile gen ifadesi ve hücre sinyalleşmesini analiz edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Lens epitel eksplant hazırlanması Dr John McAvoy 9 laboratuvar kökenli yöntemler adapte edilmiştir. Bu çalışma, İntramural Araştırma Programı Z01-EY000238-22 Ulusal Göz Enstitüsü tarafından finanse edilmektedir

Bölüm 1: lenslerin kaldırılması Malzemeler ve reaktifler: <ol><li> Mikro-diseksiyon makas, eğri, künt ipuçları, (böyle as.RS-5983, Roboz Cerrahi Instrument Co, Inc, Gaithersburg, MD); mikro diseksiyon cımbız, kavisli ucu (Roboz # RS5137 gibi). </li><li> Süspansiyon orta: Orta 199, 100 ünite sığır serum, albumin / ml penisilin% 0.1, 100μg/ml streptomisin, 2.5 mikrogram / ml Amfoterisin B Reaktifler içeren Invitrogen, Carlsbad, CA mevcuttur. </li></ol> Prosedür: <ol><li> National Institutes of Health, Bethesda, MD tarafından sağlanan yönergelere uygun olarak yeni doğan ratlarda Euthanize (2-4 gün arası). </li><li> Cerrahi makas ile göz kapaklarını çıkarın. Dışarıya doğru çıkıntı göz zorlamak için göz soket ters tarafta kavisli cımbız ile hafifçe basın. Makas ile gözün arka tarafında küçük bir kesi olun. Kesi karşısında göz kenarına cımbız ile basarak, lens ve bağlı vitreus küçük bir miktar daha sonra objektif kıvrımlı cımbız ile alınır sağlayan, rüptür sonucu zorla olabilir. Bakım lens kapsül kırmak için değil alınmalıdır. </li><li> 5ml sıcak, steril süspansiyon orta içeren bir 60mm plastik doku kültürü çanak lensler aktarmak için kavisli bir cımbız kullanın. </li></ol> Bölüm 2: eksplant Mikrodisseksiyon Malzemeler ve reaktifler: <ol><li> Mikro Diseksiyon cımbız, 0,1 mm ipuçları, (Roboz RS-4976 gibi). Biz çünkü ucu esneklik Dumostar alaşım kullanabilirsiniz, ancak diğer çelik alaşımları de kabul edilir. Bu işlem sırasında mola veya viraj eğilimindedir 0.1mm daha ince ipuçları ile cımbız, tavsiye edilmez. </li><li> Süspansiyon orta (bkz. Bölüm 1) </li><li> Ham F12 orta veya Orta 199 (Invitrogen, Carlsburg, CA) Unsupplemented </li></ol> Prosedür: <ol><li> Aşağıdaki adımları steril kesme aletleri ve steril ortamda kullanarak, temiz, taslak ortamda yapılmalıdır. </li><li> Stereo diseksiyon mikroskop kullanarak, 0.1 mm uçlu cımbız ile yapışan herhangi bir doku lenslerinizi temiz ve 5ml steril süspansiyon orta (bu adım kirliliği azaltmak için yardımcı olur) içeren ikinci bir 60mm kültür çanağı aktarabilirsiniz. Cımbız ile istenilen sayıda lens, 35mm kültür çanak 5ml steril, unsupplemented orta içeren bir transfer. (Daha düşük boya konsantrasyonu diseksiyon daha kolay hale getirir, çünkü Biz sık sık, bu adım için Ham F12 (Invitrogen) kullanmak; Ancak, Orta 199 de kabul edilebilir olan bu adımı sırasında yok antibiyotik ya da diğer ekleri ihtiyaç duyulmaktadır..) 12 eksplantlar yapılmış olması. Gibi gibi birçok Bu boyuttaki bir çanak merkezi. Ancak, daha az eksplantlar kesme aletleri küçük bir tabak içinde kolayca manipüle edilebilir, çünkü yapılması bile 35 mm çanak kullanılmalıdır. 37 az bir doku kültürü inkübatör kalan lensler içeren çanak Transfer ° C kadar ihtiyaç vardır. </li><li> Lensin arka tarafında belirleyin. Bunu tanımak için birçok yol vardır: 1) posterior, anterior, daha hafif basık yuvarlak, diseksiyon sırasında oda sıcaklığı gibi serin 2) Yenidoğan sıçan lensler soğuk katarakt formu. Soğuk katarakt lensi tamamen dolu değilse, arka tarafı opak bölgeden uzak tarafı. Opacity çanak 37 ısınma, objektif doldurdu ° C&#39;de birkaç dakika için tersine dönecektir. Arka tarafında soğutma üzerine katarakt reformlar olarak tespit edilebilir. 3) tunika vaskulosa lentis İzleri arka tarafında görülebilir. 4) posterior sütür arka tarafında görülebilir. Kapsül açılacak bu yana doğru arka tarafında belirlenmesi esastır. Ön tarafında Açılış lens epitel gözyaşı. </li><li> Arka tarafında tespit edildikten sonra, yukarı doğru açın ve sol cımbız lensi kavramak (sağ elini kullanan bir işçi için). Sonra küçük bir kıvrım üretmek doğru bir cımbız ile arka kapsül tutam. </li><li> Sağ cımbız ile arka kapsül tutarken, sol cımbız ile kapsül kat kavramak ve kapsül küçük bir gözyaşı yapmak zıt yönlerde iki çift cımbız çekin. </li><li> Cımbız ile geri çekilmeden kapsül kenarından kavrayarak, plastik cımbız ile çanak içine basarak, daha sonra diğer tarafta, bir tarafta ilk aşağı doğru çekin. Kapsül birçok noktada plaka sıkıca bağlı olduğu kadar, bütün lensin ekvator etrafında hareket, bu işlem birkaç kez tekrarlayın. Kapsül sol cımbız ile tutarak yavaşça sağ cımbız ile lens ekvatorda fiber hücreleri ve epitel hücreleri arasındaki eki kırmak için lif kütle kaya. Sonra alt takılı kalır kapsül / epiteli, haddeleme, uzak fiber kitle itinçanak. Çanak tüm lensler ile bu süreç devam etmektedir. Fiber kitleler (veya onlara lens proteinlerinin diğer çalışmalar için bir kaynak olarak dondurulmuş kaydetmek) çıkarın ve atın. </li></ol> Bölüm 3: Mikrodisseksiyon ve kültür merkezi eksplant Malzemeler ve reaktifler: <ol><li> Steril tek kullanımlık bisturi, # 15 bıçak, (Cincinnati Cerrahi Co Cincinnati, OH) </li><li> Kalsiyum ve magnezyum (Invitrogen, Carlsbad, CA) ile steril fosfat tamponlu salin </li><li> Kültür orta: Süspansiyon orta içeren 100ng/ml FGF-2 (Sigma Aldrich, Inc St Louis, MO). </li></ol> Prosedür: <ol><li> Steril bir neşter kullanılarak, sadece (CE) (Şekil merkezi epitel hücrelerinde oluşan merkezi bir meydanı yaklaşık 2.0mm, bir tarafta bırakarak, farklılaşma (Şekil 1A) erken aşamalarında hücreler içeren periferik epitel (PE), uzak trim 1B). </li><li> Bir biyogüvenlik kabine merkezi eksplantlar içeren çanak aktarın. Steril PBS ile bir kez 1ml taze, dengelenmiş (37 ° C,% 5 CO 2) süspansiyon orta kalsiyum ve magnezyum içeren ve 3 kere yıkayın. Bu bulaşma olasılığını büyük ölçüde azaltır yıkar. </li><li> Farklılaşma 1 neden ve 37 nemlendirilmiş, doku kültürü inkübatör eksplantlar kültür ortamı 2mL ekle ° C,% 5 CO 2. Kültür dönemleri birkaç saat gibi kısa ya da çalışılan parametreye bağlı olarak, 2-3 hafta gibi uzun uzatmak. Orta 2-3 günde bir değiştirilmesi gerekir. </li></ol> Bölüm 4: farklılaşma ile ilişkili olayların analizi için eksplantlar Hasat 1. Protein veya RNA analizi için Hasat eksplantlar Malzemeler: <ol><li> Microdissecting cımbız </li><li> SDS Lizis Tampon veya RNA daha sonra </li></ol> Prosedür: <ol><li> Kuluçka dönemi sonunda, kültür ortamı çıkarın. </li><li> Stereo diseksiyon mikroskobu kullanarak her eksplant kenarlarını hafifçe gevşetin. </li><li> Cımbız ile her eksplant kaldırın ve 100μl SDS lizis tamponu (protein analizi için) veya RNA daha sonra (RNA analizi için) ile ilgili içeren bir tüpe transfer. Eksplant cımbız sadık olmadığından emin olmak için çözüm cımbız ucu çalkalayın. </li></ol> 2. Immünofloresan için Hasat eksplantlar Malzemeler ve reaktifler: <ol><li> Fosfat, kalsiyum ve magnezyum (Invitrogen, Carlsbad, CA) ile tamponlu salin </li><li> Fosfat (Invitrogen, Carlsbad, CA) tamponlu tuz (kalsiyum ve magnezyum olmadan) </li><li> % 4 paraformaldehid (Boston Bioproducts, Worcester, MA) </li><li> Microdissecting cımbız </li><li> Hidrofobik işaretleme kalemi </li><li> Cam mikroskop lamı </li><li> Fosfat% 0.25 &#39;lik Triton X-100 tamponlu salin. </li></ol> Prosedür: <ol><li> PBS, kalsiyum ve magnezyum içeren kısaca eksplantlar durulayın. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 4 paraformaldehid ekleyerek doku sabitleyin. </li><li> Fiksatif çıkarın ve fosfat tuzlu tamponlu ile değiştirin. Sabit eksplantlar onları immün kaldırdı ve cam slaytlar transfer sağlayan, biraz sert olur. </li><li> PBS, doku pozisyonu yardımcı ve kıvrık önlemek için slaytta küçük bir damla (kalsiyum ve magnezyum olmadan) yerleştirin. Microdissecting cımbız kullanarak, eksplant asansör ve slayt açılan takın. Eksplant dokunmadan dikkatlice camına eksplant düzleştirmek için bir kağıt fitil ile sıvı çıkarın ve oda sıcaklığında 3 ila 5 dakika süreyle havada doku kurumaya bırakın. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1519/fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 A periferik epitel farklılaşması spesifik proteinlerin ifade eder. Mikrodiseksiyon hemen sonra N-kaderin gösterilen eksplant immunohistokimyasal oldu. İfade bu bölgedeki hücrelerin periferik epitel hücreleri çıkarmak için kesilmiş olabilir. B. ayırt başlamış olduğunu gösteren, bir grup çevre epitel hücreleri görülür ifade N-kaderin ve diğer farklılaşma spesifik proteinlerin. Kırmızı annulus hücrelerin yerini açık gri belirtilen küçük kare panel 1A gösterilen epitel kadranda temsil ederken N-kaderin, temsil eder. Periferik epitel ayırt etmek için henüz başlamamış tek hücreleri içeren merkezi bir kare bırakarak dört neşter kesimler tarafından kaldırılabilir.

<ol><li>McAvoy, J. W., Chamberlain, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+%28FGF%29+induces+different+responses+in+lens+epithelial+cells+depending+on+its+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor (FGF) induces different responses in lens epithelial cells depending on its concentration.</a> Development. 107 (2), 221-228 (1989).</li>
<li>Campbell, M. T., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+of+fibre+differentiation+in+cultured+rat+lens+epithelium+under+the+influence+of+neural+retina-conditioned+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Onset of fibre differentiation in cultured rat lens epithelium under the influence of neural retina-conditioned medium.</a> Exp Eye Res. 39 (1), 83-94 (1984).</li>
<li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+lens+epithelial+explants+induced+to+differentiate+into+fibres+by+fibroblast+growth+factor+%28FGF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of lens epithelial explants induced to differentiate into fibres by fibroblast growth factor (FGF).</a> Exp Eye Res. 49 (3), 479-494 (1989).</li>
<li>Golestaneh, N., Fan, J., Fariss, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+major+intrinsic+protein+%28MIP%29%2Faquaporin+0+expression+in+rat+lens+epithelia+explants+requires+fibroblast+growth+factor-induced+ERK+and+JNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Lens major intrinsic protein (MIP)/aquaporin 0 expression in rat lens epithelia explants requires fibroblast growth factor-induced ERK and JNK signaling.</a> J Biol Chem. 279 (30), 31813-31822 (2004).</li>
<li>Saravanamuthu, S. S., Gao, C. Y., Zelenka, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+is+required+for+lateral+induction+of+Jagged1+during+FGF-induced+lens+fiber+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Notch signaling is required for lateral induction of Jagged1 during FGF-induced lens fiber differentiation.</a> Dev Biol. 332 (1), 166-176 (2009).</li>
<li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-induced+lens+cell+proliferation+and+differentiation+is+dependent+on+MAPK+%28ERK1%2F2%29+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF-induced lens cell proliferation and differentiation is dependent on MAPK (ERK1/2) signalling.</a> Development. 128 (24), 5075-5084 (2001).</li>
<li>Dirks, R. P., Kraft, H. J., Van Genesen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cooperation+between+two+silencers+creates+an+enhancer+element+that+controls+both+the+lens-preferred+and+the+differentiation+stage-specific+expression+of+the+rat+beta+B2-crystallin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The cooperation between two silencers creates an enhancer element that controls both the lens-preferred and the differentiation stage-specific expression of the rat beta B2-crystallin gene.</a> Eur J Biochem. 239 (1), 23-32 (1996).</li>
<li>Yang, Y., Stopka, T., Golestaneh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+alphaA-crystallin+via+Pax6%2C+c-Maf%2C+CREB+and+a+broad+domain+of+lens-specific+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of alphaA-crystallin via Pax6, c-Maf, CREB and a broad domain of lens-specific chromatin.</a> The EMBO journal. 25 (10), 2107-2118 (2006).</li>
<li>McAvoy, J. W., T, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+retinas+promote+cell+division+and+fibre+differentiation+in+lens+epithelial+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Neural retinas promote cell division and fibre differentiation in lens epithelial explants.</a> Curr Eye Res. 3 (6), 827-834 (1984).</li>
</ol>

Sıçan lens eksplant sistemi, laboratuvarlar, objektif lifleri 21,3,4,5 lens epitel hücrelerinin terminal farklılaşma çalışma bir dizi başarıyla kullanılır olmuştur. 100ng/ml FGF-2 maruz eksplantlar morfolojisi ve birkaç gün 3,4,5 içinde sırayla görünmesini gen ekspresyon değişiklikleri dakika 6 içinde sinyalizasyon değişiklikler göstermeye başlayacaktır. Bulaşmasını önlemek için bakım alınırsa kültürler 2-3 hafta için geçerli kalır. FGF-2 önce farklılaşma işaretleri ifade herhangi bir hücre 1,5 eklenir az içerdikleri için bu protokolü açıklanan merkezi eksplantlar, farklılaşma ile ilişkili olaylar dizisi çalışmak için özellikle yararlıdır. Bu hücreler daha sonra farklılaşma ile ilgili sinyalizasyon ve transkripsiyonel olayların zaman seyrini takip etmek mümkün hale, bir kohort olarak, eş zamanlı olarak ayırt. Zaman farklı uzunluklarda kültür eksplantlar böylece sıra olaylar hakkında doğru Temporal bilgiler sağlar. Özel inhibitörleri ilgili sinyalizasyon yolları belirlemek için kültür ortamına ilave edilebilir. SDS jel elektroforezi ve immün eksplantlarındaki protein ekspresyonu analiz ya da RT-PCR ile spesifik mRNA&#39;ların ifade analiz etmek için kullanılıyor olabilir. - 20-50 mikrogram / eksplant ve RNA verim protein verimi aralığı yaklaşık 200 kültür döneminin uzunluğuna bağlı olarak 600 ng / eksplant. Biz genel olarak ortalama 5-6 eksplantlar çanak birkaç deneyleri için yeterli protein veya RNA sağlayacak bulabilirsiniz. Eksplantlar RNA gen ekspresyonu farklılaşması için kritik olabilecek yeni genlerin belirlenmesi mikroarray analizi, değerlendirilmesi için cDNA hazırlamak için kullanılabilir. Eksplantlarındaki da transfekte olabilir. Transfeksiyon verimliliği genellikle düşük olsa da, o muhabir genler assaying 4 için yeterli; 7, 8. Eksplantlar immünofloresan mikroskopi ilgi proteinlerin hücre içi yerinin belirlenmesi için yararlı bir ek biyokimyasal yöntemler sağlar. Böylece, sıçan lens eksplant hazırlanması ve kültür, in vivo teknikleri, transgenik ve knock-out farelerde üretimi gibi tamamlayıcı memeliler terminal objektif farklılaşma çalışmak için güçlü bir sistem sağlar.

terminal farklılaşma incelenmesi için hazırlanması ve rat lens epitel eksplantlar kültür

Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation

Oküler lensin ön yüzeyinde siliyer cisim altta yatan bir anüler bölgesi prolifere epitel hücreleri, bir tek tabaka ile kaplıdır. Retina difüzyon FGF, onları uzatılmış objektif lens toplu oluşturan lif hücreleri, posterior diziye ayırt etmek için indükler bölümü takiben, bu hücrelerin, posteriora göç. FGF-2 varlığı ön epitel merkezi bölgenin kültür eksplantlar lens liflerinin içine lens epitel hücreleri farklılaşma in vitro olarak uyarılabilir. Eksplantlarındaki neonatal sıçanlarda lensler, gözün lensi çıkarmadan ve lens kapsülünün diseksiyon cımbız ile arka tarafındaki kavrama hazırlanmıştır. Daha sonra arka kapsül hafifçe açık parçalanmış ve plastik bir doku kültürü çanak dibine basılı. Eksplant periferik bölgelerinde bir neşter ile silinir ve daha sonra merkezi bir bölgede, incelenmesi gereken parametreler bağlı olarak 2-3 hafta gibi uzun bir FGF-2 100ng/ml varlığında kültüre. Hafta günlük bir süre içinde yaklaşık senkronize kültürlü eksplantlar epitel hücreleri ayırt bu yana, sinyalizasyon ve gen ekspresyonu zaman ders, moleküler, biyokimyasal ve farmakolojik teknikler kullanılarak tespit edilebilir. İmmünofloresan mikroskopi, bu yöntemlerin güçlü bir yardımcı ilgi proteinlerin hücre içi lokalizasyonu gösterir ve sinyal yolları deneysel manipülasyon fizyolojik sonuçlar ortaya çıkarabilir.

FGF-2 varlığı kültüre sıçan lens epitel merkez bölgesi eksplantlarındaki eşzamanlı ayırt. Gibi kültürlerin İmmünofloresan mikroskopi gen ekspresyonu ve terminal farklılaşma ile ilgili sinyalizasyon olaylar hakkında yeni bilgiler sağlar.

Terminal Farklılaşma incelenmesi için hazırlanması ve Rat Lens Epitel eksplantlar Kültür

Oküler lensin ön yüzeyi, siliyer gövdenin altında kalan anüler bir bölgede çoğalan tek katmanlı epitel hücreleri ile kaplıdır. ...

Bu prosedür, iki ila dört günlük sıçanların lenslerinin çıkarılması ve üzerlerinde kalan dokulardan temizlenmesiyle başlar. Lensin arka tarafı belirlenir ve kapsülde küçük bir yırtık oluşturulur. Ardından kapsül aşağıya doğru soyulur ve kabın tabanına bastırılır.Bu işlem lensin tamamı boyunca tekrarlanır. Lens fiber kitlesi, yanlara doğru sallanarak uzaklaştırılır. Periferik epitel kesilerek çıkarılır ve ardından kültüre alınır.Son olarak, biyokimyasal analiz için bir deney tüpüne veya mikroskopi için bir cam lama aktarılırlar. Merhaba, ben NIH bünyesindeki Ulusal Göz Enstitüsü'nün Moleküler ve Gelişim Biyolojisi laboratuvarından Peggy Lanka. Merhaba, ben de Ulusal Göz Enstitüsü'ndeki Moleküler ve Gelişim Biyolojisi laboratuvarından Al Tu.Ben de NEI'deki aynı laboratuvardan Chung Ga. Bugün size yeni doğmuş sıçanlardan lens epitelyumunun eksize edilmesi ve kültüre edilmesi prosedürünü göstereceğiz. Diferansiyasyonun erken evrelerindeki hücreleri içeren epitelyumun periferik bölgesinin nasıl çıkarılacağını göstereceğiz.Ardından, FGF'ye maruz bırakarak kalan merkezi lens epitel hücrelerinin lens fiberlerini oluşturmak üzere farklılaşmasını nasıl uyaracağınızı göstereceğiz. Terminal farklılaşmada yer alan olayların zamanlamasını incelemek için laboratuvarımızda bu prosedürü kullanıyoruz. Kültür ortamına FGF ekledikten sonraki çeşitli zamanlarda EKSPLAN'ı topluyoruz.Ardından, western blotting ile protein ekspresyonunu, R-T-P-C-R veya mikro dizilerle RNA ekspresyonunu analiz ederiz ve ilgilenilen proteinlerin hücre içi konumlarını belirlemek için eksplantın immünboyamasını yaparız. Öyleyse, yeni doğmuş sıçanlardan lensleri çıkararak başlayalım. Başlamak için, ötanize edilmiş iki ila dört günlük sıçanların gözlerinden, küçük bir posterior insizyon yaparak ve karşı tarafa bastırarak mikro diseksiyon makasıyla lensleri çıkarın.0,1 mm uçlu cımbız kullanarak lensleri, beş mililitre sıcak steril süspansiyon ortamı içeren 60 milimetrelik plastik bir doku kültürü kabına aktarın. Lenslere yapışmış olan tüm dokuları temizleyin ve lensleri, beş mililitre steril süspansiyon ortamı içeren ikinci bir 60 milimetrelik kültür kabına aktarın. Bu işlem, cımbızla oluşabilecek kontaminasyonu azaltmaya yardımcı olur.İstenilen sayıdaki lensi, iki mililitre steril takviye edilmemiş besiyeri içeren 35 milimetrelik bir kültür kabına aktarın. Bu boyuttaki bir kabın merkezinde 12 x eksplan kadar hazırlama yapılabilir. Fazla lensler, daha önce kullanılan ikinci 60 milimetrelik kapta saklanabilir ve X eksplan hazırlamak için kullanılmadan önce bir saate kadar 37 degrees Celsius sıcaklıktaki bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirilebilir.Şimdi lensin posterior tarafını belirleyin. Bu ikisinin anterior tarafı yukarı bakacak şekilde durduğunu görebiliyorum. Onu kenarına çevireceğim, böylece yukarıdan bakabileceksiniz ve merkezdeki opak alan olan soğuk kataraktı göreceksiniz.Opak merkeze en uzak olan taraf posterior taraftır. Bu nedenle, örneği posterior tarafı üzerine gelecek şekilde çeviriyorum. Posterior tarafta, tenal vaskülitin kalıntıları olan bu çizgilenmeleri de görebilirsiniz.Bu, lensin çevresinde bulunan ve aynı zamanda arka tarafı belirleyen bir kan damarı paternidir. Doğru. Kapsülün buradan açılacak olması nedeniyle tanımlama kritik önem taşır. Lensin ön taraftan açılması epitelyumun yırtılmasına neden olacaktır.Posterior tarafı belirlemenin birçok yolu vardır. Birincisi, hafifçe düzleşmiş olan anterior tarafa göre daha yuvarlaktır. İkincisi, yeni doğmuş sıçan lensleri, diseksiyon sırasında oda sıcaklığına soğuduklarında soğuk kataraktlar oluşturur.Eğer soğuk katarakt henüz lensi tamamen doldurmamışsa, posterior taraf opak bölgeden en uzak olan taraftır. Opaklık lensi doldurmuşsa, kabın birkaç dakika boyunca 37 °C'ye ısıtılması bu durumu geri çevirecektir. Soğuma sırasında katarakt yeniden oluştuğunda posterior taraf belirlenebilir.Tunica VASIs'nin üçüncü kalıntıları posterior tarafta görülebilir. Son olarak, posterior sütür posterior tarafta görülebilir. Posterior taraf belirlendikten sonra, bu taraf yukarı gelecek şekilde çevirin ve lensi sol cımbızla destekleyin.Ardından, sağ cımbızla posterior kapsülü tutarken, posterior kapsülü küçük bir kat oluşturacak şekilde sağ cımbızla sıkıştırın; kapsül katını sol cımbızla kavrayın ve kapsülde küçük bir yırtık oluşturmak için iki cımbızı zıt yönlere doğru çekin. Geri çekilen kapsülün kenarını cımbızla kavrayıp önce bir tarafı, ardından diğer tarafı aşağı doğru çekerek cımbız yardımıyla kabın plastiğine bastırın. Kapsül plakaya sıkıca yapışana kadar lensin ekvatoru boyunca hareket ederek bu işlemi birkaç kez tekrarlayın. Birçok noktada, sol cımbızla kapsülü sabit tutarken, lens ekvatorundaki fiber hücreler ile epitelyal hücreler arasındaki bağlantıyı koparmak için sağ cımbızla fiber kütlesini nazikçe sallayın.Şimdi fiber kütlesini nazikçe çekerek, kabın tabanına yapışık kalan kapsülden yuvarlayarak ayırın. Bu işlemi kaptaki tüm lensler için tekrarlayın. Fiber kütleleri atılabilir veya dondurularak, tüm epitel açıklama (explant) mikrodiseksiyonu tamamlandığında diğer çalışmalar için lens proteini kaynağı olarak saklanabilir.Merkezi eksplanın mikro diseksiyonuna ve kültürlenmesine bakalım. Steril bir bistüri kullanarak, farklılaşmanın erken aşamalarındaki hücreleri içeren periferik epitelyumu kesin. Merkezi epitel hücrelerinden oluşan, her kenarı yaklaşık iki milimetre olan merkezi bir kare bırakın.Sadece merkezi eksplanı içeren kabı bir biyogüvenlik kabinine aktarın. Patlıcanları üç kez steril PBS ile ve bir kez bir mililitre taze dengelenmiş süspansiyon medyumu ile yıkayın. Ardından, farklılaşmayı indüklemek için iki mililitre kültür medyumu ekleyin ve eksplanı 37 °C ve %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin.Kültür süresi, incelenen parametreye bağlı olarak birkaç saat kadar kısa veya iki ila üç hafta kadar uzun sürebilir. Besiyeri, mikrodissection ve Turing complete işlemleriyle birlikte her iki ila üç günde bir değiştirilmelidir. Analiz için eksplantların hasadına başlayalım.İnkübasyon süresinin sonunda, kültür ortamını mikro diseksiyon cımbızı kullanarak uzaklaştırın. Her bir eksplanın kenarlarını nazikçe gevşetin. Her bir eksplanı cımbızla tutun ve protein analizi için yaklaşık 100 µL SDS liziz tamponu veya RNA analizi için RNA later içeren bir tüpe aktarın; eksplanın cımbıza yapışmadığından emin olmak için cımbızın ucunu solüsyon içerisinde hareket ettirin.Explanlar artık protein veya RNA analizi için hazırdır; explanlar immünofloresan ile de analiz edilebilir. Başlamak için explanları kısa bir süre PBS ile yıkayın. %4 paraformaldehit ekleyerek dokuları 30 dakika boyunca fikse edin.Oda sıcaklığında, fiksatörü uzaklaştırın ve yerine PBS ekleyin. Fikse edilmiş explanlar biraz sertleşerek cam lamlara immün boyama için kaldırılmalarına ve aktarılmalarına olanak tanır. Dokunun konumlandırılmasına yardımcı olmak ve kıvrılmasını önlemek için lama kalsiyum ve magnezyum içermeyen küçük bir PBS damlası yerleştirin. Mikro diseksiyon pensi kullanarak explanı kaldırın ve explanın dokusuna dokunmadan lam üzerindeki damlanın içine yerleştirin; sıvıyı uzaklaştırmak ve explanı cam üzerine düzlemek için dikkatlice bir kağıt fitil kullanın.Dokunun oda sıcaklığında üç ila beş dakika boyunca havada kurumasına izin verin. İmplantlar artık immunofloresan analiz için hazırdır. Burada, hücreler için bir belirteç olan NCO adhere için immun boyama yapılmış, mikrodiseksiyonla ayrılmış tüm bir epitelyal eksplant örneği gösterilmektedir.Differansiyasyonun erken evrelarında, epitelin yalnızca periferik bölgesindeki hücreler bu protein kesimi için pozitif boyanır. Bu protokolde açıklanan periferik epitel, ekspresyon gösteren hücrelerin çok az olduğu veya hiç olmadığı merkezi bir alan bırakır. Bu durum, merkezi ve periferik epitel dokularının GA.DH için western blotting analizi ile gösterilmiştir; protein örneklerinin eşit miktarda yüklendiğini doğrulamak için GA.DH western blotting kullanılmıştır.Diferansiyasyon ile ilişkili olayların zamanlaması, merkezi eksplanların farklı süreler boyunca kültüre edilmesiyle belirlenebilir. Merkezi eksplanlar, 100 ng/mL FGF içeren veya içermeyen ortamda 2, 5, 24 ve 48 saat boyunca kültüre edilmiştir. Eksplanlar belirtilen zamanlarda toplanmış ve western blotting analizi için SDS örnek tamponuna aktarılmıştır.Sonuçlar, uç koherent protein ekspresyonunun kültürde 24 ila 48 saat sonra indüklendiğini göstermektedir. GAPDH için yapılan Western blotting, protein örneklerinin eşit miktarda yüklendiğini kanıtlamaktadır.100 ng/mL FGF varlığında veya yokluğunda dört gün boyunca kültüre edilen merkezi eksplantların immünboyaması, FGF'ye maruz kalan eksplantlarda N-kaderin immünofloresansının güçlü bir şekilde arttığını göstermektedir. İmmünofloresans ayrıca n-kaderinin hücreler arası sınırlardaki subselüler lokalizasyonunu da göstermektedir.Böylece, farklılaşmayı incelemek için kültürde lens epitel hücrelerinin nasıl hazırlanacağını göstermiş olduk. Bu sistemin temel avantajı, hücrelerin senkronize bir şekilde farklılaşmasıdır. Bu durum, olaylar dizisinin belirlenmesini mümkün kılar.Ek olarak, belirli sinyal yolaklarını aktive etmek veya bloke etmek için ortama spesifik büyüme faktörleri veya inhibitörler ekleyebiliriz. Bu işlem gerçekleştirilirken, diseksiyonu ve steril ortam hazırlığını temiz bir ortamda yaparak ve kültürleme öncesinde eksplantları iyice inceleyerek kontaminasyona karşı önlem almayı hatırlamak önemlidir. İşte bu kadar.İzlediğiniz için teşekkür ederiz. Deneyinizde başarılar dileriz. Hoşça kalın.

preparation-culture-rat-lens-epithelial-explants-for-studying

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kök hücre kaynaklı retina pigment epitel (RPE) hücreleri, retina dejenerasyonu için hücre bazlı tedaviler, hastalık modellemesi ve ilaç çalışmaları dahil olmak üzere birçok uygulama için kullanılabilir. Burada, kök hücrelerden RPE'nin tekrarlanabilir bir şekilde türetilmesi için basit bir protokol sunuyoruz.

Kök Hücreleri Retina pigment epiteli hücrelerinin Verimli türetilmesi

Anjiyogenez, fizyolojik olarak ilgili bir ortamda araştırılması gereken çok hücreli, çok sistemli etkileşimleri içerir. Bu çalışmanın amacı, sıçan mezenter kültürü modelinin, anjiyogenez sırasında sağlam mikrovasküler ağların hızlandırılmış karşılaştırmalarını yapma yeteneğini göstermektir.

bir<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Yöntem kültürlü Rat Mezenterik Mikrovasküler Ağları Time-Lapse Görüntüleme için

Retina pigment epitel hücrelerinin insan amniyotik membran ve hayvan modellerinde aşılama için hazırlık üstüne kültürlü insan pluripotent kök hücreler elde oluşan bir retina doku mühendisi bir yöntem açıklanmaktadır.

Transplantasyonu uygun Retina Pigment epitel doku mühendisliği insan embriyonik kök hücrelerden türetilmiş

Nöral yaralanmadan sonra koku alma glia (OEG) nörojeneratif kapasitesini değerlendirmek için bir in vitro model sunuyoruz. RGN aksonal ve somatodendritik belirteçleri analiz ederek, OEG monolayerleri üzerinde axotomized adult retinal ganglion nöronlarının (RGN) bir kokülatürüne ve daha sonra aksonal rejenerasyon çalışmasına dayanmaktadır.

Beyazlatılmış Sıçan Retinal Ganglion Nöronlarının Koku Alma Ensheathing Glia ile Birlikte, Yetişkin Aksonal Rejenerasyonun In Vitro Modeli Olarak

Protokol, fare nöroretinasınınorganotipik eksplantlarını açıklar Retina pigment epiteliyle (RPE) birlikte yetiştirilen, R16 tanımlı ortamda, serum ve antibiyotik içermez. Bu yöntemin in vivo deneylere kıyasla gerçekleştirilmesi nispeten basit, daha az pahalı ve zaman alıcıdır ve çok sayıda deneysel uygulamaya uyarlanabilir.

Sağlam Retina Pigment Epitel ile Organotipik Fare Retina Eksplantlarının Uzun Süreli, Serumsuz Ekimi

Bu çalışma, eksplant kullanımı sırasında retina bütünlüğünü tehlikeye atmayı önleyen yeni bir insan organotipik retina kültürü (HORC) modeli geliştirmeyi amaçlamaktadır. Bu, retinanın aşırı vitreus ve alttaki retina pigment epitel-koroid (RPE-choroid) ve sklera ile kültleşmesi ile elde edilir.

Yeni bir İnsan Organotipik Retina Kültürü Tekniğinin Karakterizasyonu

İlk olarak 20161'deFernandez-Godino ve arkadaşları tarafından bildirilen bu protokol, Transwell plakalarında bir hafta içinde işlevsel ve polarize bir RPE monolayer oluşturan fare RPE hücrelerini verimli bir şekilde izole etmek ve kültüre etmek için bir yöntem tanımlamaktadır. İşlem yaklaşık 3 saat sürer.

Birincil Fare Retina Pigment Epitel Hücrelerinin Verimli Diseksiyonu ve Kültürü

Bu protokol, yetişkin bir fareden elde edilen retinal eksplantların izolasyonu, diseksiyonu, kültürlenmesi ve boyanması için adımları sunar ve açıklar. Bu yöntem, diyabetik retinopati gibi farklı retinal nörovasküler hastalıkları incelemek için ex vivo bir model olarak faydalıdır.

Retinal Nörovasküler Hastalıkları İncelemek için Ex Vivo Modeli Olarak Yetişkin Fare Retinasının Retinal Eksplantı

Bu makale, katarakt ve arka kapsül opaklaşmasında (PCO) tekrarlanabilirliği iyileştirmeyi ve araştırmalara yardımcı olmayı amaçlayan primer lens epitel hücrelerinin (LEC'ler) kültürlenmesi için ayrıntılı bir video protokolünü özetlemektedir. Lens diseksiyonu, LEC izolasyonu ve validasyonu hakkında adım adım talimatlar sunarak, özellikle bu alanda yeni başlayanlar için değerli bir rehber görevi görür.

Fare Primer Lens Epitel Hücre Kültürünü Optimize Etme: Tripsinizasyon için Kapsamlı Bir Kılavuz

Kornea sütürleri ile birlikte kornea epitel küretajı yoluyla şiddetli kornea iltihabının bir sıçan modeli geliştirdik. Çalışma, enflamatuar koşullar altında kornea iltihabı paternlerini, epitel proliferasyonunu ve limbal kök hücrelerdeki değişiklikleri değerlendirdi.

Kornea Sütürleri ile Kombine Kornea Epitel Küretajına Dayalı Sıçanlarda Şiddetli Kornea İnflamasyonu Modelinin Oluşturulması

Bu protokol, fare oküler lens epiteli ile fiber hücre yığın kütlesinin ayrılmasını, ardından RNA izolasyonunu ve qPCR analizini detaylandırır. Bu yöntem, epitel hücrelerinde ve farklılaşmış lif hücrelerinde transkriptom ve biyolojik süreçlerin daha ayrıntılı bir analizi için lens hücresi bölmelerinin ayrılmasına izin verir.

Fare Oküler Lens Epitelinden ve Fiber Hücre Yığın Kitlelerinden RNA İzolasyonu

Öğrenin, yeni doğan sıçan lens epitel eksplantlarını FGF-2 ile kültüre ederek terminal farklılaşma sürecini nasıl inceleyeceğinizi. İmmünofloresan mikroskopi ile gen ifadesi ve hücre sinyalleşmesini analiz edin.

Terminal Farklılaşma incelenmesi için hazırlanması ve Rat Lens Epitel eksplantlar Kültür

Daha fazla video keşfet