Terminal Farklılaşma incelenmesi için hazırlanması ve Rat Lens Epitel eksplantlar Kültür

Bu prosedür, lenslerin iki ila dört günlük sıçanlardan çıkarılması ve yapışan dokulardan temizlenmesi ile başlar. Lensin arka tarafı tanımlanır ve kapsülde küçük bir yırtık yapılır. Kapsül daha sonra aşağı doğru soyulur ve tabağın dibine bastırılır.

Bu işlem tüm lens boyunca tekrarlanır. Lens lifi kütlesi yana doğru sallanarak çıkarılır. Periferik epitel kesilir ve daha sonra kültürlenir.

Son olarak, biyokimyasal analiz için bir test tüpüne veya mikroskopi için bir cam lam üzerine aktarılırlar. Merhaba, ben Peggy Lanka, NIH Ulusal Göz Enstitüsü'nde Moleküler ve Gelişimsel Biyoloji laboratuvarındayım. Merhaba, ben Al Tu, aynı zamanda Ulusal Göz Enstitüsü Moleküler ve Gelişimsel Biyoloji Laboratuvarı'ndanım.

Ben Chung Ga, aynı zamanda NEI'deki aynı laboratuvardanım. Bugün size yeni doğan sıçanlardan lens epitelinin eski planlaması ve kültürlenmesi için bir prosedür göstereceğiz. Farklılaşmanın erken aşamalarında hücreler içeren epitelin periferik bölgesini nasıl çıkaracağınızı göstereceğiz.

Ardından, kalan merkezi lens epitel hücrelerini, onları FGF'ye maruz bırakarak lens lifleri oluşturmak üzere farklılaşmaya nasıl teşvik edeceğinizi göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda, terminal farklılaşmasında yer alan çiftlerin zamanlamasını incelemek için kullanıyoruz. EXPLAN'ı kültür ortamına FGF ekledikten sonra çeşitli zamanlarda hasat ediyoruz.

Daha sonra western blotlama ile protein ekspresyonunu, R-T-P-C-R veya mikro diziler ile RNA ekspresyonunu analiz ediyoruz ve ilgilenilen proteinlerin hücre altı yerleşimini belirlemek için eksplanı immün boyalıyoruz. Öyleyse, yeni doğan farelerin lenslerini hareket ettirerek başlayalım. Başlamak için, küçük bir arka kesi yaparak ve karşı tarafa bastırarak ötenazi yapılmış iki ila dört ded sıçanın gözlerinden lensleri çıkarmak için mikro diseksiyon makası kullanın.

Lensleri, 0,1 milimetre uçlu cımbız kullanarak orta düzeyde beş mililitre ılık steril süspansiyon içeren 60 milimetrelik bir plastik doku kültürü kabına aktarın. Lenslerden yapışan dokuları temizleyin ve bunları beş mililitre steril süspansiyon ortamı içeren ikinci bir 60 milimetrelik kültür kabına aktarın. Bu, cımbızla kontaminasyonu azaltmaya yardımcı olur.

İstenilen sayıda lensi, iki mililitre steril unsu takviyeli ortam içeren 35 milimetrelik bir kültür kabına aktarın. Bu boyuttaki bir yemeğin ortasında 12 x exrelease yapılabilir. Ekstra lensler, daha önceki 60 milimetrelik ikinci tabakta saklanabilir ve X exlät'ı yapmak için kullanılmadan önce bir saate kadar 37 santigrat derecede bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirilebilir.

Şimdi lensin arka tarafını tanımlayın. Bu ikilinin ön tarafları yukarıda olacak şekilde oturduklarını söyleyebilirim. Onu kenara çevireceğim, böylece aşağıya bakabilirsiniz ve merkezde opak bir alan olan soğuk kataraktı göreceksiniz.

Opak merkezden en uzak taraf arka taraftır. Bu yüzden onu arka tarafa çeviriyorum. Arka tarafta, bu tenal vaskülitin kalıntıları olan bu çizgileri de görebilirsiniz.

Lensin çevresinde yer alan ve aynı zamanda arka tarafı da işaretleyen bir kan damarı modelidir. Doğru. Kapsülün açılacağı yer burası olduğu için tanımlama çok önemlidir. Lensin ön taraftan açılması epiteli yırtacaktır.

Arka tarafı tanımlamanın birçok yolu vardır. Birincisi, hafifçe düzleştirilmiş olan ön taraftan daha yuvarlaktır. İkincisi, yenidoğan sıçan lensleri, diseksiyon sırasında oda sıcaklığına soğudukça soğuk katarakt oluşturur.

Soğuk katarakt henüz lensi tam olarak doldurmamışsa, arka taraf opak bölgeye en uzak olan taraftır. Opaklık lensi doldurduysa, çanağı birkaç dakika 37 santigrat dereceye kadar ısıtmak onu tersine çevirecektir. Arka taraf, soğuduktan sonra kataraktın yeniden oluşması olarak tanımlanabilir.

Tunika VASI'lerin üçüncü kalıntıları arka tarafta görülebilir. Son olarak, posterior sütür posterior tarafta görülebilir. Arka taraf belirlendikten sonra, yukarı doğru çevirin ve lensi sol cımbızla destekleyin.

Daha sonra arka kapsülü sağ cımbızla tutarken küçük bir kıvrım oluşturmak için arka kapsülü sağ cımbızla sıkıştırın, kapsül katlamasını sol cımbızla kavrayın ve geri çekilen kapsülün kenarını cımbızla kavrarken kapsülde küçük bir yırtık oluşturmak için iki cımbızı zıt yönlerde çekin, Önce bir tarafında, sonra diğer tarafında aşağı doğru çekin ve cımbızla tabağın plastiğine bastırın. Bunu birkaç kez tekrarlayın, kapsül plakaya sıkıca bağlanana kadar lensin ekvatorunun her tarafını hareket ettirin. Birçok noktada, kapsülü sol cımbızla yerinde tutarak, lif hücreleri ile lens ekvatorundaki epitel hücreleri arasındaki bağlantıyı kırmak için lif kütlesini sağ cımbızla hafifçe sallayın.

Şimdi lif kütlesini yavaşça çekin ve tabağın dibine bağlı kalan kapsülden yuvarlayın. Bu işlemi tabaktaki tüm lenslerle tekrarlayın. Lif kütleleri atılabilir veya dondurulabilir ve tüm epitel ekplanının mikrodiseksiyonu tamamlanan diğer çalışmalar için bir lens proteini kaynağı olarak saklanabilir.

Mikro diseksiyon ve kültür merkezi explan'a bakalım. Steril bir neşter kullanarak, farklılaşmanın erken aşamalarında hücreler içeren periferik epiteli kesin. Merkezi epitel hücrelerinden oluşan, her iki tarafta yaklaşık iki milimetre olan merkezi bir kare bırakarak.

Sadece merkezi x explan'ı içeren kabı bir biyogüvenlik kabinine aktarın. Patlıcanları üç kez steril PBS ile ve bir kez bir mililitre taze dengelenmiş süspansiyon ortamı ile yıkayın. Daha sonra, farklılaşmayı indüklemek için iki mililitre kültür ortamı ekleyin ve explan'ı 37 santigrat derece,% 5 karbondioksitte nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin.

Kültür periyodu, çalışılan parametreye bağlı olarak birkaç saat kadar kısa veya iki ila üç hafta kadar sürebilir. Ortam, mikrodiseksiyon ve Turing tamamlandıktan sonra her iki ila üç günde bir değiştirilmelidir. Eksplantları analiz için hasat etmeye başlayalım.

Kuluçka süresinin sonunda, mikro diseksiyon cımbızı kullanarak kültür ortamını çıkarın. Her x explan'ın kenarlarını nazikçe gevşetin. Her bir eksplanı cımbızla kavrayın ve protein analizi için yaklaşık 100 mikrolitre SDS lizis tamponu veya daha sonra RNA analizi için RNA içeren bir tüpe aktarın, eksplanın cımbıza yapışmamasını sağlamak için cımbızın ucunu solüsyonda

Explan artık protein veya RNA analizi için hazırdır, explan ayrıca immünofloresan ile de analiz edilebilir. Başlamak için PBS'de kısa bir süre durulayın. 30 dakika boyunca %4 para formaldehit ekleyerek dokuları sabitleyin.

Oda sıcaklığında, fiksatifi çıkarın ve PBS ile değiştirin Sabit dış kısım biraz sertleşir, bu da kaldırılmalarına ve immüno-boyama için cam slaytlara aktarılmalarına izin verir. Dokuyu konumlandırmaya ve kıvrılmayı önlemeye yardımcı olmak için slayta kalsiyum ve magnezyum içermeyen küçük bir damla PBS yerleştirin. Mikro diseksiyon cımbızı kullanarak, explan'ı kaldırın ve explan'a dokunmadan slayttaki damlaya yerleştirin, sıvıyı çıkarmak ve explan'ı cam üzerinde düzleştirmek için dikkatlice bir kağıt fitil kullanın.

Dokuyu oda sıcaklığında üç ila beş dakika havada kurumaya bırakın. İmplantlar artık immünofloresan analizi için hazırdır. Burada, hücreler için bir belirteç yapıştıran NCO için immün leke olan bir mikrodiseksiyon bütün epitelyal ekplan örneği gösterilmektedir.

Farklılaşmanın erken aşamalarında, sadece epitelin periferik bölgesindeki hücreler bu proteinin kesilmesi için pozitif olarak boyanır. Bu protokolde tarif edildiği gibi periferik epitel, eğer varsa, ifade eden ve tutarlı olan az sayıda hücre içeren merkezi bir dış plan bırakır. Bu, batı blotlama, GA için merkezi ve periferik epitel dokuları ve uyumlu western blotlama ile gösterilir. Protein örneklerinin eşit olarak yüklendiğini doğrulamak için DH kullanıldı.

Farklılaşma ile ilişkili olayların zamanlaması, merkezi explan'ın farklı zaman dilimleri için kültürlenmesiyle belirlenebilir. Merkezi explan, orta genişlikte veya mililitre başına 100 nanogram olmadan 2, 5, 24 ve 48 saat boyunca kültürlendi. FGF X explan belirtilen zamanlarda hasat edildi ve western blotlama ile analiz edilmek üzere SDS numune tamponuna aktarıldı.

Sonuçlar, son tutarlı protein ekspresyonunun 24 ila 48 saat sonra indüklendiğini göstermektedir. Kültürde. GA DH için Western blotlama, protein örneklerinin eşit olarak yüklendiğini göstermektedir.

İmmün boyama merkezi Explan, mililitre başına 100 nanogramın yokluğunda veya varlığında dört gün boyunca kültürlenir. FGF, maruz kalınan eksplanda N kaderin immünofloresansının güçlü bir şekilde yükseldiğini göstermektedir. FGF immünofloresan ayrıca hücreden hücreye sınırlarda n kaderinin hücre altı lokalizasyonunu gösterir.

Bu yüzden size farklılaşmayı incelemek için kültür merceği epitellerinde nasıl hazırlanacağınızı gösterdik. Bu sistemin temel avantajı, hücrelerin eşzamanlı olarak farklılaşmasıdır. Bu, olayların sırasını belirlemeyi mümkün kılar.

Ek olarak, belirli sinyal yollarını aktive etmek veya bloke etmek için ortama spesifik büyüme faktörleri veya inhibitörler ekleyebiliriz. Bu prosedürü yaparken, temiz bir ortamda diseksiyon ve steril ortam yaparak kontaminasyona karşı korunmayı ve kültürlemeden önce explan'ı iyice izlemeyi unutmamak önemlidir. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler. Denemenizde iyi şanslar. Güle güle.Güle güle.