Osmotik Kaçınma IN Caenorhabditis elegans: İki Genler Synaptic Fonksiyonu, İnsan Orthologues NRXN1 Ve NLGN1 olarak Adaylar

Merhaba, ben İspanya'daki Cordova Üniversitesi Genetik Bölümü'nden Manuel Ruiz Rubio. Otizm çalışmalarında, C. elegans'ın karakteristik sinir sisteminden yararlanarak bu organizmayı deneysel bir araç olarak kullanıyoruz. Nematodun, nöral sinapsla ilişkili ve otizmle bağlantılı olduğu belirlenen genlerde etkili olan mutantlarını inceliyoruz.

Rein Reganlar, sinaptik bölgede bulunan membran adezyon molekülleridir. C. elegans'ın baş kısmı, ozmotik kuvvet dahil olmak üzere farklı uyarılara karşı yanıtları aracılık eden, nematodun duyusal organı olan amfiyi içerir. Amfi, yüksekliğe göre ilişkili 12 duyusal bipolar nöron ve bir INAP terminal aksiyonundan oluşur.

Bu nöronlardan ikisi, sağ ve sol A SH nöronları, ozmotik duyusal işlev açısından özellikle önemlidir. Yüksek ozmotik kuvvete sahip suda çözünür dengesizlikleri tespit ederler. A Nan River yöntemi, The ance'in sinaps kusurlu mutantlarında ozmotik kaçınmayı ölçmek için kullanılan bir yöntemdir.

Nöro ve yüksek ozmotik basınçtan kaçınmanın etkilerini değerlendirmek için, dört molar fruktoz çözeltisine dayalı bir yöntem kullanarak, C'nin nöral genleri kusurlu mutantlara karşı gösterdiği farklı yanıtları rapor ettik. Uygulama gününde, %1 Kongo kırmızısı içeren dört molar fruktoz stok çözeltisi hazırlayın ve oda sıcaklığında tamamen çözünmesini sağlayın. NGM plakası üzerindeki katı ortamın merkezine, bir santimetre çapında bir halka çizilir.

15 µL kırmızı dört molar fruktoz çözeltisi kullanın. Fruktozun agar içine yaklaşık beş dakika boyunca emilmesini bekleyin; deney körleme yöntemiyle yürütülmelidir. Her bir suşun bulunduğu plaka, ikinci bir deneyci tarafından S8 olarak etiketlenmelidir.

SA, bu işaretler istenmediğinde gerçekleştirilir. Deney tamamlandıktan yaklaşık 24 saat önce, her genotipten dört L4 larva seçilip e coli bakterileri içeren AFL NGM plaklarına aktarılmalı ve ertesi güne kadar 20 °C'de tutulmalıdır. Deneye genç yetişkinlerle başlanmalıdır.

Her suştan tek bir solucanı dinlenme dairesine yerleştirin ve her bir hayvanın tic bariyerine verdiği yanıtın süresini takip edin. Kesin bir sonuç elde etmek için her suştan 10 hayvanla çalışılmalı ve en az üç tekrarlı deney gerçekleştirilmelidir. Kırmızı halkadan art arda altı kez kaçınanlar normal olarak sınıflandırılır.

Altı denemeden daha kısa sürede halkadan çıkanlar, ozmotik duyarlılık açısından defektif kabul edilir; her SA Bristol'de kontrol suşu kullanılmalı ve halka bariyerinden kaçındıkları için iki hayvan pozitif kontrol olarak kullanılmalıdır. Kontrol suşları, dört molar fruktozdan oluşan ozmotik bir bariyerle karşılaştıklarında geri giderek tepki verirler. Nöro-yetersiz mutant bombalar, bu bakımdan bir tip güce benzer bir davranış sergilerler.

Buna karşın, NEUR eksik olan mutantlar bu ozmotik bariyeri tespit edemediler. Farklı aktif neur ve nout alellerine sahip çift mutantlar, ozmotik güce yanıt veren yabanı tip fenotibini yeniden kazandılar. RNA interferans beslemesi yoluyla solucanların susturulması için, hedef gene karşılık gelen bir fragman içeren L 44 40 vektörü ile transforme edilmiş olan e coli HD 11 beş suşundan koloniler izole edilir. Bakteriler ertesi gün karbonik içeren LBA veya plakalara izole edilir.

Bir bakteri kolonisi seçin ve LV sıvı besiyerine inoküle edin. 37 °C'de çalkalayarak yaklaşık yedi saat boyunca büyütmeye devam edin. Bu kültürden, karbonik tavan ve IPTG içeren NGM plak üzerine damlatma yapın ve oda sıcaklığında gece boyunca bekleyerek bakterilerin büyümesine ve hedef gen fragmanının ekspresyon indüksiyonunun başlamasına izin verin.

RNA interferans için pozitif ve negatif bir kontrol kullanılması gereklidir. Besleme deneyleri. Negatif kontrol eşittir.

TL 44 40 vektörü ile transforme edilmiş HT 11 beş suşu kullanılmıştır. Pozitif kontroller, 22 gen dizisini içeren L 44 40 vektörü ile transforme edilmiş ELI HT 11 beş hücreleridir. Bu genin nakavt edilmesiyle ortaya çıkan sarsıntılı fenotip, steril mikroskop altında kolayca ayırt edilebilmektedir.

Birinci Gün. NGM PLA üzerindeki bakterili dört evreli L formlar, bakterili bir plakaya aktarılır ve 20 °C'de 12 saat boyunca bekletilir. Bu bir açlık dönemidir.

Ertesi gün, hızlı gelişen genç yetişkini, spesifik RNA interferens hedef genini eksprese eden bakterilerle ekilmiş bir plağa taşıyın. F1 dölünü elde etmek için yaklaşık 48 saat boyunca 20 °C'de bekletin. Ardından, sonraki iki gün içinde birkaç F1 yetişkin bombusunu aynı bakterilerin ekildiği başka bir plağa seçerek aktarın.

F2 dölünden genç yetişkinleri seçin ve izole edin. Fenotipler için Bristol N2 vahşi tip suşunun bakterilerle birlikte yaşadığı ortamlarda skorlama yapın. L44 40 vektörü, ozmotik bariyer inceyken geriye doğru gidiyordu.

C. elegans'tan neur geninin bir fragmanını eksprese eden bakterilerle beslenen Bristol ve gerçek beyaz tip suşları, 2 Molar çözeltileri tespit edememiştir. Ancak, ozmotik bariyeri tespit edemeyen neur eksik mutantlar, C. elegans'tan neur geninin bir fragmanını eksprese eden bakterilerle beslendiklerinde bu kapasiteyi geri kazanmışlardır. Bu videoda, C. elegans'taki ozmotik kaçınma yanıtını etkileyen genlerin etkilerini incelemeye olanak tanıyan basit bir yöntemi gösteriyoruz.

Osmotik güce karşı verilen yanıtı analiz etmek için Congo Red ile fruktoz formal sıkı halkası kullanılır. Eksik mutantlardaki nöroloji bu yanıtta kusurludur, ancak NU mutantları tomo stresini tespit etme yeteneklerini kaybetmemiş olup yabani tip suşa benzer bir yanıt göstermektedir. Bu video, ing ve salgılayıcı genlerde farklı tive nakavt alelleri taşıyan çift mutant suşların, osmotik güce yanıt veren yabani tip fenotipini geri kazandığını göstermektedir.

Bu gözlemler, besleme yoluyla kilitlenme (lockdown) yaklaşımı kullanılarak RNA interferansı ile doğrulanmıştır. Bu sayede, ING geninin ilgili dizisini eksprese eden bakterilerle beslendiğinde, yabani tip suşun osmotik bariyeri tanıma yeteneği bozulmuştur. Öte yandan, daha yüksek konsantrasyonlu fruktoz çözeltilerini tespit edemeyen nöron kusurlu mutantlar, NNU geninin ilgili dizisini eksprese eden bakterilerle beslendiklerinde bu davranıyı yeniden kazanmışlardır.

Bu deneyde gösterilen sonuçlar, n seeing ve neur proteinlerinin nematodun duyusal nöronlarının sinaptik bağlantısında yer alabileceğini ve ayrıca sinaptik fonksiyonu etkileyecek şekilde birbirleriyle etkileşime girdiklerini göstermektedir. Tamamdır, hoşça kalın ve deneylerinizde başarılar dilerim.