Name: Osmotik Kaçınma IN Caenorhabditis elegans: İki Genler Synaptic Fonksiyonu, İnsan Orthologues NRXN1 Ve NLGN1 olarak Adaylar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-11T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Keşfedin Caenorhabditis elegans'ta osmotik kaçınma davranışını inceleyen genetik yöntemleri. Nöroligin ve nöreksin mutasyonlarının sinaptik fonksiyon üzerindeki etkilerini ve otizm araştırmalarındaki önemini öğrenin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz onun değerli yardım için teşekkür Dr. Antonio Miranda Vizuete istiyorum. Ayrıca değerli teknik yardım için Salma Boulayoune ve Isabel Caballero minnettarlığımızı ifade etmek istiyorum. Bu çalışma Junta de Andalucia (BIO-272) bir hibe ile finanse edilmiştir. Bu araştırma, Avrupa&#39;da genetik deneyler düzenleyen mevcut yasa ile anlaşma yapılmıştır.

1: Osmotik kaçınma tahlil. <ol><li> OP50 E. içeren taze bir NGM plaka tahlil Hakkında 16-24 saat önce, her genotipin L4 larva aşamasında hayvan almak coli, 20 ° C'de bu andincubate Ertesi gün genç yetişkinler denemeyi başlatmak. </li><li> Bu tahlil, "körü körüne" yürütmek için tavsiye edilir. Test edilecek her suşu ile plakaları deney tamamlandığında maskesiz olurdu relabelled plakaları kullanılarak tahlil yapılması, ikinci bir deneyci tarafından relabelled olmalıdır. </li><li> Testin gün,% 1 Kongo Red çözümü ile fruktoz 4M stok solüsyon hazırlanır ve oda sıcaklığında tamamen çözülür. Boya ile çökelti nedeniyle her bir deney için önce çözüm kontrol öneriyoruz. </li><li> NGM plaka Anülüs halkası (1 cm çap) 15 ul kırmızı 4M fruktoz çözüm, katı orta merkezi özetlenmiştir. Fruktoz çözüm agar içine bekletin ki, bu genellikle 2 ile 5 dakika arasında sürer. </li><li> Ring içinde her bir suş bireysel genç yetişkin hayvanların yerleştirin ve osmotik bariyer yanıtı belirlemek için, sonraki 10 dakika içinde uygulayın. Arka arkaya altı kez daha halka kaçınarak hayvanlar normal olarak sınıflandırılır; az altı girişimleri halka çıkmadan bu osmotik hassasiyet kusurlu kabul edilir. Not: Kontrol suşu her tayininde kullanılması gerekir. Kararlı bir şekilde halka bariyer önlemek N2 genç yetişkin hayvanların pozitif kontrol olarak kullanılır. Daha önce, açlıktan, Dauer larvaları geçen ya da çok kuru plakalar gelen edilmiştir Hayvanlar kullanılmamalıdır. Başlangıçta, kontrol hayvanları tahlil plakalar ve çözümün doğru olup olmadığını teyit etmek için, iki nüsha halinde değerlendirilir olmalıdır. </li></ol> 2: RNAi besleme demonte solucanlar Üretimi. <ol><li> RNAi plakaları: NGM RNAi besleme plakaları litre başına içerir: 17 g agar, 2,5 g pepton, 3.0 g NaCl, 1, 5 mg ml -1 kolesterol ml H 2 O ve otoklav ile 1 litrelik şişeyi doldurmak . Agar yaklaşık 65 soğuduktan sonra ° C, 1 M KPO 4, pH 6.0, 1 M CaCl 1M MgSO 4, 0,5 ml carbenicillin (50 mg ml -1) ve 1, 2, 1 ml 1 ml, 25 ml eklemek ml 1M IPTG. Hazırlanan katı NGM ile başlayan iseniz, mikrodalga katı besiyeri eritmek ve daha sonra serin ve daha sonra da belirttiğim gibi KPO 4, pH 6.0, CaCl 2, MgSO 4, carbenicillin ve IPTG eklemek bankta sıvı NGM. Her 60 mm Petri kabı içine NGM 10 ml ekleyin. İzin soğutma ve geceleme kullanmadan önce oda sıcaklığında muhafaza plakaları ters. Plakalar 4 ° C'de 4-5 gün boyunca plastik bir torba içinde saklanabilir. </li><li> Bakteriyel hazırlanması ve endüksiyon: Luria-Bertani (LB) agar plakları (17 g agar, 10 g Tripton, 5 gr üzerine, hedef genin karşılık gelen bir parça içeren L4440 vektör ile dönüştürülmüş E.coli HT115 (de3) suşu kolonileri, ayırma maya özü, litre başına 10 gr NaCl), ampisilin (50 mg / ml) ve tetrasiklin (15 mg / ml) içeren. Bir bakteri kolonisi Alış ve 50 mikrogram / ml ampisilin ile LB aşılamak ve 6 8 saat süreyle 37 ° sallayarak yetiştirilen ° C; hazırlanan NGM plakaların üzerine tohum, bu kültürün bir damla ve gecede kuluçka olmaktan iyice tabak kuru ( oda sıcaklığında 12 24 h) bakterilerin üremesine izin ve indüksiyon başlamak için. Tetrasiklin, ışığa karşı hassastır ve plakalar arasında RNAi testlerinin değişkenlik etkileyebilir, çünkü karanlık inkübasyon oldu. RNAi beslenme deneyleri için bir pozitif ve negatif kontrol kullanmak için gerekli. Pozitif kontrol E.coli HT115 hücre unc-22 gen sekansı içeren L4440 vektör ile dönüştürülmüş. Unc-22 gen demonte "seğirmesi fenotip" üretir. Negatif kontrol E.coli HT115 hücre boş L4440 vektör ile dönüştürdü. </li><li> Solucan kullanımı ve puanlama: bakteri ve inkübe olmadan NGM plakalar üzerine OP50 20 numaralı seribaşı bir NGM plakadan ilk gün, yer L4 aşamada solucanlar ° C 12 saat boyunca (açlık). Ertesi gün genç oruç tuttuklarını yetişkin çift cinsiyetli, bakterilerin belirli hedef gen RNAi ifade ile seedded bir tabağa aktarın. 40-48 saat 20 ° C F1 döl oluşturmak için bırakın. Ardından aynı bakteri ile seribaşı başka bir tabağa birkaç F1 erişkin solucanlar yerleştirin. 24-48 saat sonra, seçin ve F2 döl, genç yetişkinler (birkaç yumurta ile tam olarak oluşan çıkıntı vulva) ve fenotipleri için puan izole. Not: nöronlarda RNAi indüksiyon RNAi C elegans sinir sistemi refrakter özellikleri nedeniyle bazı sınırlamalar var. Nöron bu verimsizlik sorunları aşmak için rrf-3 suşu, nöronlar 10 RNAi etkileri aşırı duyarlı bir arka plan kullanılması tavsiye edilir. Deneyimlerimizden hiçbir differences genler için Bristol N2 ve rrf-3 suşları arasında bulundu ve fenotip incelendi. </li></ol> 3: Suşlarının kullanılır. C. Tablo 1'de bu çalışmada kullanılan elegans suşları gösterilmiştir. Mutant-çapraz N2 karşı vahşi tip mutagenez protokolü sırasında oluşan olabilirdi istenmeyen rastlantısal mutasyonlar kaldırmak için en az dört kez. OP50 E. coli suşu, plazmid nrx-1 taşıyan pL4440 (JA: C29A12.5). Caenorhabditis Genetik Merkezi, Minnesota Üniversitesi, ABD E.coli HT115 (de3) suppliied ve NLG-1 (JA: C40C9.5 Dr. Peter Askjaer, Centro Andaluz de biología del Desarrollo (CABD), CSIC Universidad Pablo Olavide, Sevilla, İspanya) gen parçaları temin edilmiştir. 4: Temsilcilik sonuçları. Örnek sonuçlar Şekil 1 ve 2 'de temsil ediliyor. On her bir suş hayvanlar ve en az üç kopya deneyler yapılmıştır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/1616/1616Fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Osmotik kaçınma davranışı deneyler. Kontrol suşları ve nrx-1 V eksik mutantworms osmotik bir bariyer (4M fruktoz) karşılaştığınızda geriye doğru ters cevap (ok1649 ve tm1961). NLG-1 (ok259 ve tm474) X mutantlar Bu bariyer algılamak için başarısız olur. VX ve CRR23 (tm1961; ok259); NLG-1 ve nrx-1, suşları CRR21 (ok259 ok1649) eksik Çift mutantlar VX vahşi tip fenotipi iyileşti. * T-öğrenci testi ile her suşu Bristol N2 yabani tip tepki, t-öğrenci testi ile anlamlı bir fark (p ≤ 0.001), gösterir <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/1616/1616Fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. RNAi besleyerek demonte solucanlar deneyler. E.coli HT115 (de3) boş pL4440 vektör ile dönüştürülmüş veya nrx-1 veya NLG-1 ile beslenen farklı solucan suşları için kullanılan hedef genleri ile ilgili bir parçası içeren . * Boş pL4440 vektör ile beslenen N2 suşu ile karşılaştırma pL4440 vektör NLG-1 geni hedefleyen bir parçası taşıyan bakteri ile beslenen N2 suşu yanıt, t-öğrenci testi ile anlamlı bir fark (p ≤ 0.001), gösterir .

<ol><li>Sudhof, T. C. Nature. 455 (7215), 903-903 (2008).</li>
<li>Fabrichny, I. P., Leone, P., Sulzenbacher, G. Neuron. 56 (6), 979-979 (2007).</li>
<li>Garber, K. Science. 317 (5835), 190-190 (2007).</li>
<li>Wang, K., Zhang, H., Ma, D. Nature. 459 (7246), 528-528 (2009).</li>
<li>Ward, S., Thomson, N., White, J. G. The Journal of comparative neurology. 160 (3), 313-313 (1975).</li>
<li>Bargmann, C. I., Thomas, J. H., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+Spring+Harbor+symposia+on+quantitative+biology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cold Spring Harbor symposia on quantitative biology.</a> 55, 529-529 (1990).</li>
<li>White, J. G., Southgate, E., Thomsom, J. N., Brenner, S. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 314, 1-1 (1986).</li>
<li>Culotti, J. G., Russell, R. L. Genetics. 90 (2), 243-243 (1978).</li>
<li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K. Nature. 391 (6669), 806-806 (1998).</li>
<li>Timmons, L., Fire, A. Nature. 395 (6705), 854-854 (1998).</li>
<li>Simmer, F., Tijsterman, M., Parrish, S., Koushika, S. P., Nonet, M. L., Fire, A., Ahringer, J., Plasterk, R. H. Curr Biol. 12, 1317-1317 (2002).</li>
<li>Missler, M., Zhang, W., Rohlmann, A. Nature. 423 (6943), 939-939 (2003).</li>
<li>Varoqueaux, F., Aramuni, G., Rawson, R. L. Neuron. 51 (6), 741-741 (2006).</li>
<li>Graf, E. R., Zhang, X., Jin, S. X., Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J. Cell. 119 (7), 1013-1013 (2004).</li>
<li>Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J. Cell. 101 (6), 657-657 (2000).</li>
<li>Jamain, S., Quach, H., Betancur, C. Nature genetics. 34 (1), 27-27 (2003).</li>
<li>Szatmari, P., Paterson, A. D., Zwaigenbaum , L. Nature genetics. 39 (3), 319-319 (2007).</li>
</ol>

Neurexins ve neuroligins sinaptik iletim 11 ve sinaptik bağlantıları 12 farklılaşma önemli rolleri yerine. Her iki molekülleri için aday genler, otizm 13,14 olarak tespit edilmiştir. Bu video C. osmotik kaçınma yanıtını etkileyen genlerin etkisini araştırmak için bize sağlayan basit bir yöntem elegans. Neuroligin eksik mutantlar osmotik gücü tespit kusurlu ama neurexin eksikliği mutantlar 4M fruktoz çözümü kaçınarak, vahşi tip zorlamalara be...

Tablo 1. C. elegans suşları. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Gerginlik </td><td> Gen </td><td> Allel </td><td> Kaynak </td></tr><tr><td> Bristol N2 </td><td> - </td><td> - </td><td> aCGC </td></tr><tr><td> VC228 </td><td> NLG-1 </td><td> ok259 </td><td> CGC </td></tr><tr><td> FX00474 </td><td> NLG-1 </td><td> tm474 </td><td> bNBP-JAPONYA </td></tr><tr><td> VC1416 </td><td> nrx-1 </td><td> ok1649 </td><td> CGC </td></tr><tr><td> FX1961 </td><td> nrx-1 </td><td> tm1961 </td><td> NBP-JAPONYA </td></tr><tr><td> NL2099 </td><td> rrf-3 </td><td> pk1436 </td><td> CGC </td></tr><tr><td> CRR21 </td><td> nrx-1; NLG-1 </td><td> ok1649; ok259 </td><td> Bu çalışma </td></tr><tr><td> CRR22 </td><td> nrx-1; NLG-1 </td><td> tm1961; ok259 </td><td> Bu çalışma </td></tr></tbody></table> a. Caenorhabditis Genetik Merkezi, Minnesota Üniversitesi, ABD. b. Deney Hayvanları &quot;nematodu C. elegans&quot; Ulusal Bioresource Projesi. Tokyo Kadın Tıp Üniversitesi, Japonya.

osmotik kaçınma in caenorhabditis elegans: İki genler synaptic fonksiyonu, İnsan orthologues nrxn1 ve nlgn1</emotizm> olarak adaylar

Osmotic Avoidance in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function of Two Genes, Orthologues of Human NRXN1 and NLGN1, as Candidates for Autism

Neurexins ve neuroligins hücre adezyon moleküllerinin eksitatör ve inhibitör sinaps mevcut ve doğru nöron ağ fonksiyonu 1 için gereklidir. Bu proteinler, presinaptik ve postsinaptik membranlar 2 bulunur . Farelerde yapılan çalışmalar, neurexins ve neurologins sinaptik iletim 1 önemli bir role sahip olduğunu göstermektedir. Son raporlar, insan sinir sisteminin gelişimi sırasında değişmiş nöron bağlantıları otizm spektrum bozuklukları (3) çok sayıda vaka etyolojisi temel teşkil edebilir göstermiştir . Caenorhabditis elegans nedeniyle laboratuar deneyleri için sadeliği, deneysel bir araç olarak çalışma sinaptik bileşenlerinin işleyişini kolaylaştırmak için kullanılır, ve, sinir sistemi ve sinaptik kablolama tam olarak karakterize edilmiştir vermiştir olabilir. C elegans nrx-1 ve NLG-1 genleri sırasıyla alfa-neurexin-1 ve neuroligin-1 protein, kodlamak NRXN1 ve NLGN1 genlerin insan için orthologous. Neuroligins neurexins ve organizasyon, insan ve nematod, fonksiyonel alanlar bakımından benzer. Nematod başkanı amphid, osmotik gücü dahil olmak üzere farklı uyaranlara verilen yanıtlar aracılık nematod, bir duyu organı içerir. Amphid siliyalı dendrit ve tek bir presinaptik terminal akson 4 ile 12 duyusal bipolar nöronların yapılır. ASHR ve ashl adlı bu nöronlar, iki yüksek osmotik gücü 5 suda çözünür kovucular tespit osmotik duyusal fonksiyon özellikle önemlidir. Bu iki nöron dendritler ağız ucu uzatmak ve davranışsal yanıt 6 belirleyen diğer nöronlarla sinaptik bağlantıları aksonlar sinir halkası kadar uzanır. Yüksek osmotik gücü kaçınma neurexin ve neuroligin etkilerini değerlendirmek için, 7 4M fruktoz halka dayalı bir yöntem kullanarak, nrx-1 ve NLG 1 genlerin arızalı C. elegans mutantlar farklı tepki gösterir. Davranışsal fenotipleri belirli RNAi klonlar 8 kullanarak teyit edildi. C. elegans, RNAi tetiklemek için gerekli dsRNA 9 beslenme uygulanabilir. Gıda yoluyla dsRNA teslim ilgi böylece genetik bileşenleri ve ağ yollar kimlik sağlayan gen RNAi parazite neden olur.

Neurexins ve neuroligins sinaptik farklılaşma ve iletiminde önemli rolleri yerine membran nöron yapışma proteinleri. Neuroligin, eksik mutantlar<em&gt; C. elegans</em&gt; Osmotik gücü tespit kusurlu, ama onlar da neurexin kodlayan gendeki bir mutasyon içerdiğinde, onlar vahşi tip fenotip kurtarabilirsiniz.

Osmotik Kaçınma IN Caenorhabditis elegans: İki Genler Synaptic Fonksiyonu, İnsan Orthologues NRXN1 Ve NLGN1</emOtizm> olarak Adaylar

Neureksinler ve nöroliginler, eksitatör ve inhibitör sinapslarda bulunan hücre yapışma molekülleridir ve nöron ağının doğru işleyişi için gereklidirler1. Bu proteinler presinaptik ve postsinaptik membranlarda bulunur2. Fareler üzerinde yapılan çalışmalar, neureksinlerin ve nöroliginlerin sinaptik iletimde temel bir rol oynadığını göstermektedir1. Güncel raporlar, insan sinir sisteminin gelişimi sırasında meydana gelen nöronal bağlantı değişikliklerinin, çok sayıda otizm spektrum bozukluğu vakasının etiyolojisinin temelini oluşturabileceğini ortaya koymuştur3. Caenorhabditis elegans; laboratuvar deneyleri için basitliği, sinir sisteminin ve sinaptik bağlantılarının tamamen karakterize edilmiş olması nedeniyle, sinaptik bileşenlerin işleyişinin incelenmesini kolaylaştıran deneysel bir araç olarak kullanılabilir. C. elegans'taki nrx-1 ve nlg-1 genleri, sırasıyla alfa-neureksin-1 ve nöroligin-1 proteinlerini kodlayan insan NRXN1 ve NLGN1 genlerinin ortologlarıdır. İnsanlarda ve nematodlarda, neureksin ve nöroliginlerin organizasyonu fonksiyonel domainler açısından benzerdir. Nematodun baş kısmı, ozmotik kuvvet dahil olmak üzere farklı uyarılara verilen yanıtları yöneten bir duyu organı olan amfidi içerir. Amfid, silli dendritlere ve tek bir presinaptik terminal aksona sahip 12 duyusal bipolar nöronla oluşur4. Bunlardan ASHR ve ASHL olarak adlandırılan iki nöron, yüksek ozmotik kuvvete sahip suda çözünür repellentleri tespit ederek ozmotik duyusal işlevde özellikle önemli rol oynarlar5. Bu iki nöronun dendritleri ağız ucuna kadar uzanır ve aksonları, davranışsal yanıtı belirleyen diğer nöronlarla sinaptik bağlantılar kurdukları sinir halkasına kadar uzanır6. Neureksin ve nöroliginin yüksek ozmotik kuvvetten kaçınma üzerindeki etkilerini değerlendirmek için, 4M fruktoz halkasına dayalı bir yöntem kullanarak nrx-1 ve nlg-1 genlerinde defektli C. elegans mutantlarının farklı yanıtlarını gösteriyoruz7. Davranışsal fenotipler, spesifik RNAi klonları kullanılarak doğrulanmıştır8. C. elegans'ta, RNAi'yı tetiklemek için gerekli olan dsRNA, besleme yoluyla verilebilir9. dsRNA'nın gıda aracılığıyla iletilmesi, ilgili genin RNAi interferansını indükleyerek genetik bileşenlerin ve ağ yollarının tanımlanmasına olanak tanır.

Merhaba, ben İspanya'daki Cordova Üniversitesi Genetik Bölümü'nden Manuel Ruiz Rubio. *C. elegans*'ın tamamen karakterize edilmiş sinir sisteminden faydalanarak, otizm çalışmalarında bu canlıyı deneysel bir araç olarak kullanıyoruz. Sinaptik bağlantılarda yer alan ve otizmle ilişkilendirilen genlerde kusurları olan nematod mutantlarını inceliyoruz.Neureksinler ve nöroliginler, sinapslarda bulunan membran yapışma molekülleridir. C. elegans'ın baş kısmı, ozmotik kuvvet dahil olmak üzere farklı uyarılara verilen yanıtları yöneten bir nematod duyusal organı olan amfidi içerir. Amfid, silli dendritlere sahip 12 duyusal bipolar nöron ve bir presinaptik terminal aksonundan oluşur.Bu nöronlardan ASHR ve ASHL olarak adlandırılan ikisi, yüksek osmotik güce sahip suda çözünür iticileri tespit ederek osmotik duyusal fonksiyonda özellikle önemli bir rol oynar. C. elegans'ın sinaps kusurlu mutantlarında osmotik kaçınmayı ölçmek için 4M fruktoz halkası yöntemini kullandık.Neureksin ve nöroliginin yüksek ozmotik basınçtan kaçınmadaki etkilerini değerlendirmek için, 4M fruktoz çözeltisine dayalı bir yöntem kullanarak nrx-1 ve nlg-1 genlerinde defektli mutantların C. elegans'a karşı farklı yanıtlarını bildirdik. Uygulama gününde, %1 Kongo kırmızısı içeren 4M'lık bir fruktoz stok çözeltisi hazırlayın ve oda sıcaklığında tamamen çözünmesini sağlayın. NGM plakası üzerindeki katı besiyerinin merkezine, bir santimetre çapında halkasal bir ring çizin.15 µL kırmızı 4M fruktoz çözeltisi kullanın. Fruktozun agar içerisine yaklaşık beş dakika boyunca nüfuz etmesini bekleyin; deney körleme yöntemiyle gerçekleştirilmelidir. Her suşun bulunduğu plaka, ikinci bir deneyci tarafından etiketlenmelidir.SA, bu işaretlerin istenmediği şekilde gerçekleştirilir. Deney, satıştan yaklaşık 24 saat önce tamamlandığında, her genotipten dört adet L4 larvası seçmek ve bunları e coli bakterileri içeren bir AFL NGM plakasına aktarıp ertesi güne kadar 20 °C'de muhafaza etmek gerekir. Deneye genç yetişkinlerle başlanmalıdır.Her suştan birer adet solucanı dinlenme dairesine yerleştirin ve her hayvanı, tik bariyerine verdiği yanıtı zamanlayarak takip edin. Kesin bir sonuç elde etmek için her suştan 10 hayvanla ve en az üç tekrarlı deney gerçekleştirilmelidir. Kırmızı halkadan art arda altı kez kaçınanlar normal olarak sınıflandırılır.Altı denemeden daha kısa sürede halkadan çıkanlar, osmoz hassasiyetinde kusurlu olarak kabul edilir; her SA Bristol'de kontrol suşu kullanılmalı ve halka bariyerinden kaçındıkları için iki hayvan pozitif kontrol olarak kullanılmalıdır. Kontrol suşları, dört molar fruktozdan oluşan bir osmotik bariyerle karşılaştıklarında geri giderek tepki verirler. Nöronal eksikliği olan mutantlar, yüksek osmotik güç açısından buna benzer bir davranış sergilerler.Bununla birlikte, NEUR eksik mutantları bu ozmotik bariyeri tespit edememiştir. Farklı aktif neur ve nout alellerine sahip çift mutantlar, ozmotik güce yanıt veren yabanıl tip fenotipini yeniden kazanmıştır. RNA interferans besleme yoluyla solucanların indirgenmesini sağlamak için, hedef gene karşılık gelen bir fragman içeren L 44 40 vektörü ile transforme edilmiş E. coli HD 115 suşu kolonileri izole edilir. Bakteriler, ertesi gün karbonatlı LBA veya plak üzerine izole edilir.Bir bakteri kolonisi seçin ve LV sıvı besiyerine inoküle edin. 37 °C'de çalkalamalı inkübatörde yaklaşık yedi saat boyunca büyümeye bırakın. Bu kültürden bir damlayı, karbonik tavan ve IPTG içeren NGM plakasına damlatın ve bakterilerin büyümesine ve hedef gen fragmanının ekspresyon indüksiyonunun başlamasına izin vermek için oda sıcaklığında gece boyunca bekletin.RNA interferansı için pozitif ve negatif bir kontrol kullanılması gereklidir. Besleme deneyleri. Negatif kontrol eşittir.TL 44 40 vektörü ile transforme edilmiş HT 11 five suşları. Pozitif kontroller, 22 gen dizisini içeren L 44 40 vektörü ile transforme edilmiş ELI HT 11 five hücreleridir. Bu genin nakavtı, steril mikroskop altında kolayca ayırt edilebilen sarsıntılı bir fenotip oluşturur.Birinci Gün. Bakterili NGM PLA'dan dört adet L4 evresindeki canlı, bakterili plaklara aktarılır ve 12 saat boyunca 20 °C'de bekletilir. Bu bir açlık dönemidir.Ertesi gün, hızlı büyüyen genç yetişkinleri, spesifik RNA interferans hedef genini eksprese eden bakterilerle ekilmiş plakaya taşıyın. F1 neslini elde etmek için 20 °C'de yaklaşık 48 saat bekletin. Ardından, sonraki iki gün boyunca birkaç F1 yetişkinini aynı bakterilerle ekilmiş başka bir plakaya seçip aktarın.F2 progeny içerisinden genç yetişkinleri seçin ve izole edin. Fenotipler için Bristol N2 vahşi tip suşunun bakterilerle beslendiği ortamda değerlendirme yapın. L44 40 vektörü, ozmotik bariyer üzerinden geri giderken kullanılmıştır.C. elegans'tan neur geninin bir fragmanını eksprese eden bakterilerle beslenen Bristol ve true white tip suşları, 4M molar çözeltileri tespit edememiştir. Bununla birlikte, osmotik bariyeri tespit edemeyen neur eksik mutantlar, C. elegans'tan nlg-1 geninin bir fragmanını eksprese eden bakterilerle beslendiklerinde bu kapasiteyi geri kazanmışlardır. Bu videoda, C. elegans'ta osmotik kaçınma yanıtını etkileyen genlerin etkisini incelemeye olanak tanıyan basit bir yöntemi gösteriyoruz.Osmotik güce karşı verilen yanıtı analiz etmek için Kongo Kırmızısı ile beraber fruktoz formal halkası kullanılır. Neuroligin eksikliği olan mutantlar bu yanıtta kusurludur; ancak, NU mutantlarının ozmotik stresi algılama yetenekleri bozulmamıştır ve yabani tip suşa benzer bir yanıt göstermektedirler. Bu video, nrx ve nlg genlerinde farklı aktif nakavt allelleri taşıyan çift mutant suşların, osmotik güce yanıt veren yabani tip fenotipini geri kazandığını göstermektedir.Bu gözlemler, besleme yöntemiyle RNA interferansı kullanılarak doğrulanmıştır. Bu sayede, ilgili ING geni dizisini eksprese eden bakterilerle beslendiğinde, yaban tipi suşun osmotik bariyeri tanıma yeteneği bozulmuştur. Öte yandan, 4M fruktoz çözeltisini tespit edemeyen nlg defektif mutantlar, ilgili NNU geni dizisini eksprese eden bakterilerle beslendiklerinde bu davranışı geri kazanmışlardır.Bu deneyde gösterilen sonuçlar, nrx-1 ve nlg-1'in nematodun duyusal nöronlarının sinaptik bağlantılarında rol oynayabileceğini ve ayrıca sinaptik fonksiyonu etkileyecek şekilde birbirleriyle etkileşime girdiklerini göstermektedir. Tamam, hoşça kalın ve deneylerinizde başarılar dilerim.

osmotic-avoidance-caenorhabditis-elegans-synaptic-function-two-genes

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video iki sinir uyarıcı, aldicarb ve pentylenetetrazole (PTZ), nematod, C. elegans sinaptik fonksiyonu çalışma tamamlayıcı yollardan nasıl istihdam göstermektedir. Bu modüle nöronal senkronizasyonu için evrimsel olarak korunmuş mekanizmaları tamamlayıcı bir yaklaşım da ışık tutmak için kullanılan ve epilepsi ve nöbet etkileri olabilir.

C. elegans Sinaptik İletim Mutants farmakolojik karakterizasyonu için Paradigmalar

Mikroarray analizi genetik ekspresyon profillerini belirlemek için...

Genetik İfade Profilleri Belirlenmesi C. elegans Mikroarray ve Real-time PCR

Bu videoda, bir transgenik solucan modelinde kemokaçınma davranışını incelemek için bir ozmotik kaçınma testi açıklanmaktadır. Kaçınma davranışı, yüksek ozmotik bir bariyer ve kemoatraktan varlığında bir plakada test edilir. Fonksiyonel nöron kaybı olan solucanlar kemoatraktan tarafından çekilir, yüksek ozmotik bariyeri geçer ve anestezik çözelti nedeniyle tuzak bölgesinde felç olur.

Ozmotik Kaçınma Testi Kullanarak Transgenik Solucanlarda Kemokaçınma Davranışını İnceleyin

DsRNA C. beslerken elegans büyük ölçekli besleme ekranlar için geçerli protokoller değişken devirme verimleri elde gen fonksiyonunu değerlendirmek için güçlü bir araçtır. Bu gen ifadesinin oldukça etkili ve yeniden üretilebilir bir devirme ile sonuçlanan büyük ölçekli RNAi besleme ekranları yerine getirmek için geliştirilmiş bir protokol açıklar.

Büyük ölçekli Gen demonte olarak<em&gt; C. elegans</em&gt; Sağlam Kayıp fonksiyon-fenotipleri oluşturmak için DsRNA Besleme Kitaplıklar kullanma

Burada, stresli bireylerin kaçınma durumunu ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bu paradigma güçlü ancak kullanıcı dostudur ve Drosophila melanogaster'de genlerin ve çevrenin bir tür sosyal etkileşim üzerindeki etkisini değerlendirmek için kullanılabilir.

Sosyal Kaçınma Niceleme için Basit Testi Drosophila melanogaster

Burada, organizmanın iyi beslenmiş bir beslenme durumundan aç kalmış beslenme durumuna geçmesiyle bakırdan kaçınma davranışındaki ve ortak bir besin kaynağını bulma yeteneğini değerlendirmek için tasarlanmış Caenorhabditis elegans spesifik bir analiz sunuyoruz.

bir<emCaenorhabditis elegans</emBeslenme Durumuna Dayalı Bakır Kaçınma Deneyi

Daha önce Caenorhabditis elegans'ın sırasıyla kitlesel ve aralıklı eğitim yoluyla kısa ve uzun vadeli ilişkisel anılar oluşturması için protokoller geliştirdik. Burada, C. elegans'ın koşullandırılması için, 1-propanol ve hidroklorik asidi, sırasıyla koşullu ve koşulsuz uyaranlar olarak eşleştirerek, engelleyici ilişkisel hafıza oluşturmak için ayrıntılı protokoller açıklanmaktadır.

Caenorhabditis elegans'ta İki Kimyasalın Eşleştirilmesiyle Engelleyici İlişkisel Öğrenme ve Hafıza Oluşumu

Otizm Spektrum Bozukluğu (OSB), bozulmuş sosyal ve iletişimsel davranış ve tekrarlayan davranışların ortaya çıkması ile ilişkilidir. Drosophila modelinde ASD genleri ve davranışsal eksiklikler arasındaki ilişkiyi incelemek için, bu yazıda sosyal boşluk, saldırganlık, kur yapma, tımar etme ve alışkanlık davranışını test etmek için beş davranışsal paradigma açıklanmaktadır.

Otizm Spektrum Bozukluğunun Drosophila Modelinde Davranışsal Değerlendirme Paradigmaları

Kemirgen modelleri, otizm spektrum bozukluğu (ASD) ile ilgili temel davranışları incelemek için değerli araçlardır. Bu makalede, farelerde ASD'nin temel özelliklerini modellemek için iki davranış testini açıklıyoruz: tekrarlayan davranışları değerlendiren kendi kendini tımar etme ve sosyal bozuklukları belgeleyen üç odacıklı sosyal etkileşim testi.

Farelerde Otistik Benzeri Davranışları Değerlendirme Stratejileri

Dinamik kelepçe elektrofizyolojisi, nöronal ateşleme eksiklikleri ile iyon kanalı disfonksiyonu arasında nedensel bağlantılar kurabilir. Fare serebellar Purkinje nöronlarında dinamik kelepçe yöntemlerini ve protokollerini açıklıyoruz, faydalı kaynaklara ve teknik hususlara dikkat çekiyoruz. Temsili bir çalışmada, tekrarlayan ateşlemeyi kurtarmak için Tsc1-/- Purkinje nöronlarına modellenmiş sodyum iletkenliği ekliyoruz.

Otizmle İlişkili Bozulmuş Nöronal Uyarılabilirliği Araştırmak için Dinamik Kelepçe Yöntemleri

Bu protokol, Drosophila melanogaster larvalarının merkezi sinir sisteminde tanımlanmış nöronal partnerler arasındaki fonksiyonel sinaptik aktiviteyi in vivo olarak değerlendirir; genetik olarak kodlanmış araçlar kullanılır. Presinaptik cIVda duyusal nöronların CsChrimson aracılı optogenetik uyarısı, postsinaptik Basin-4 internörlerinde CaMPARI'nin kalsiyuma bağlı fotodönüşümünü indükler.

CaMPARI kullanılarak Drosophila larva merkezi sinir sisteminde bireysel pre- ve postsinaptik partnerlerin fonksiyonel karakterizasyonu

Keşfedin Caenorhabditis elegans'ta osmotik kaçınma davranışını inceleyen genetik yöntemleri. Nöroligin ve nöreksin mutasyonlarının sinaptik fonksiyon üzerindeki etkilerini ve otizm araştırmalarındaki önemini öğrenin.

Osmotik Kaçınma IN Caenorhabditis elegans: İki Genler Synaptic Fonksiyonu, İnsan Orthologues NRXN1 Ve NLGN1 olarak Adaylar

Daha fazla video keşfet