Name: Büyük ölçekli Gen demonte olarak C. elegans Sağlam Kayıp fonksiyon-fenotipleri oluşturmak için DsRNA Besleme Kitaplıklar kullanma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-25T19:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 38 s
Description: Keşfedin C. elegans'ta gen fonksiyonlarını incelemek için dsRNA besleme kitaplıklarıyla büyük ölçekli RNAi tarama yöntemini. Bu protokol, gen susturma verimliliğini artırarak nörobilim ve genetik araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Sağlık MH097163 National Institutes fonları tarafından desteklenmiştir. Bazı suşlar Araştırma Altyapı Programları NIH Ofisi (P40-OD010440) tarafından finanse CGC tarafından sağlanmıştır.

<ol><li>Mello, C. C., Conte, D. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+world+of+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Revealing the world of RNA interference.</a> Nature. 431 (7006), 338-342 (2004).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+in+C.+elegans%3A+soaking+in+the+genome+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence.</a> Science. 282 (5388), 430-431 (1998).</li>
<li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interference+by+ingested+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854(1998).</li>
<li>Jose, A. M., Smith, J. J., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Export+of+RNA+silencing+from+C.+elegans+tissues+does+not+require+the+RNA+channel+SID-1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Export of RNA silencing from C. elegans tissues does not require the RNA channel SID-1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2283-2288 (2009).</li>
<li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li>
<li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).</li>
<li>Simmer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+of+C.+elegans+using+the+hypersensitive+rrf-3+strain+reveals+novel+gene+functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi of C. elegans using the hypersensitive rrf-3 strain reveals novel gene functions.</a> PLoS Biol. 1, 77-84 (2003).</li>
<li>Lee, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+RNAi+screen+identifies+a+critical+role+for+mitochondria+in+C.+elegans+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity.</a> Nat. Genet. 33 (1), 40-48 (2003).</li>
<li>Sieburth, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+genes+required+for+synapse+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of genes required for synapse structure and function.</a> Nature. 436 (7050), 510-517 (2005).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 2 (1), (2001).</li>
<li>Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyotype%2C+ploidy%2C+and+gene+dosage%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Karyotype, ploidy, and gene dosage.</a> WormBook. , 1-9 (2005).</li>
<li>Kennedy, S., Wang, D., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+siRNA-degrading+RNase+negatively+regulates+RNA+interference+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans.</a> Nature. 427 (6975), 645-649 (2004).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+misexpression+of+germline+P+granules+and+enhanced+RNA+interference+in+retinoblastoma+pathway+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants.</a> Nature. 436 (7050), 593-597 (2005).</li>
<li>Lackner, M. R., Nurrish, S. J., Kaplan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+synaptic+transmission+by+EGL-30+Gqalpha+and+EGL-8+PLCbeta%3A+DAG+binding+to+UNC-13+is+required+to+stimulate+acetylcholine+release%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Facilitation of synaptic transmission by EGL-30 Gqalpha and EGL-8 PLCbeta: DAG binding to UNC-13 is required to stimulate acetylcholine release.</a> Neuron. 24 (2), 335-346 (1999).</li>
<li>Bastiani, C. A., Gharib, S., Simon, M. I., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+Galphaq+regulates+egg-laying+behavior+via+a+PLCbeta-independent+and+serotonin-dependent+signaling+pathway+and+likely+functions+both+in+the+nervous+system+and+in+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans Galphaq regulates egg-laying behavior via a PLCbeta-independent and serotonin-dependent signaling pathway and likely functions both in the nervous system and in muscle.</a> Genetics. 165 (4), 1805-1822 (2003).</li>
<li>Lickteig, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neurotransmitter+vesicles+by+the+homeodomain+protein+UNC-4+and+its+transcriptional+corepressor+UNC-37%2Fgroucho+in+Caenorhabditis+elegans+cholinergic+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons.</a> J. Neurosci. 21 (6), 2001-2014 (2001).</li>
<li>Terami, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+organization%2C+expression%2C+and+analysis+of+the+troponin+C+gene+pat-10+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genomic organization, expression, and analysis of the troponin C gene pat-10 of Caenorhabditis elegans.</a> J Cell Biol. 146 (1), 193-202 (1999).</li>
<li>Novelli, J., Page, A. P., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C+terminus+of+collagen+SQT-3+has+complex+and+essential+functions+in+nematode+collagen+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The C terminus of collagen SQT-3 has complex and essential functions in nematode collagen assembly.</a> Genetics. 172 (4), 2253-2267 (2006).</li>
<li>Brundage, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+a+C.+elegans+Gqalpha+gene+disrupt+movement%2C+egg+laying%2C+and+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutations in a C. elegans Gqalpha gene disrupt movement, egg laying, and viability.</a> Neuron. 16 (5), 999-1009 (1996).</li>
<li>Gönczy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+cell+division+in+C.+elegans+using+RNAi+of+genes+on+chromosome+III%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III.</a> Nature. 408 (6810), 331-336 (2000).</li>
<li>Miller, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+unc-4+gene+encodes+a+homeodomain+protein+that+determines+the+pattern+of+synaptic+input+to+specific+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">elegans unc-4 gene encodes a homeodomain protein that determines the pattern of synaptic input to specific motor neurons.</a> Nature. 355, 841-845 (1992).</li>
<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+Caenorhabditis+elegans+unc-4+gene+alter+the+synaptic+input+to+ventral+cord+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations in the Caenorhabditis elegans unc-4 gene alter the synaptic input to ventral cord motor neurons.</a> Nature. 355, 838-841 (1992).</li>
<li>Johnson, N. M., Behm, C. A., Trowell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+and+inducible+gene+knockdown+in+C.+elegans+using+Wormgate+and+the+ORFeome%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Heritable and inducible gene knockdown in C. elegans using Wormgate and the ORFeome.</a> Gene. 359, 26-34 (2005).</li>
<li>Wani, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D1+dopamine+receptor+signaling+is+modulated+by+the+R7+RGS+protein+EAT-16+and+the+R7+binding+protein+RSBP-1+in+Caenoerhabditis+elegans+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">D1 dopamine receptor signaling is modulated by the R7 RGS protein EAT-16 and the R7 binding protein RSBP-1 in Caenoerhabditis elegans motor neurons.</a> PLoS One. 7 (5), e37831(2012).</li>
<li>Beifuss, K. K., Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+screening+to+identify+postembryonic+phenotypes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">RNAi screening to identify postembryonic phenotypes in C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (60), e3442(2012).</li>
</ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Biz C. büyük ölçekli ekranlar gerçekleştirmek için piyasada mevcut DsRNA besleme kitaplığı kullanan bir protokol tanımlanmıştır elegans. Biz kütüphane çoğaltmak ve etkili bir şekilde kullanmak için tüm talimatları sağlar. Bu yaklaşım, hayvanın farklı dokularda farklı biyolojik proseslerde yer alan genleri tanımlamak mümkün olduğunu göstermektedir. Burada tarif fenotipleri (UNC, Egl ve dpy) kolayca gözlemlenebilir olsa da, bu protokol, hemen hemen herhangi bir biyolojik işlem için gerekli olan genlerin ...

C. Tarihsel olarak, genetik ekranlar elegans DNA içinde rasgele mutasyona oluşturmak için, örneğin etil metansülfonat gibi bir kimyasal mutajen ile hayvanların tedavi edilmesi ile gerçekleştirilmiştir. Mutagenize edilmiş hayvanların soyu veya grandprogeny sonra sergilediğini arzu edilen bir anormal bir fenotip izole edilir. Fenotipe neden sorumlu mutasyon daha sonra bir emek-yoğun bir eşleme prosedürü ile ya da mutant solucan tüm genom sekanslama ile tanımlanır. Orada, kazanım fonksiyon-of ve zarar fonksiyon-fenotipler neden olabilir solucan genomu içinde kalıcı lezyonlar oluşturmak gibi kimyasal mutagenez ekranlar performans için pek çok avantajı vardır, ancak eşleme prosedürü yavaş ve pahalıdır. Çift kollu bir RNA girişimi (dsRNAi) önemli biyolojik proseslerde yer alan genleri tanımlamak için alternatif bir yol sağlar. Bu yöntemde, bir endojen genin kodlama dizisi eşleşen dsRNA solucan sokulur.DsRNA kılavuzları yok 1 için onları hedef, uygun endojen mRNA bulmak ve bağlamak üzere görev küçük (21-22 nükleotid) RNA&#39;ları oluşturmak için in vivo olarak işlenir. Bu prosedür nispeten hızlı olduğunu, ancak dsRNA&#39;nın yerine DNA&#39;dan daha mRNA hedefleri nedeniyle, sadece azaltma fonksiyon-fenotipleri bu yaklaşımı kullanılarak gözlenmiştir. Bir hayvana dsRNA&#39;lar sokulması dsRNA 3 hayvanları ıslatarak ya da 4 dsRNA eksprese hayvan bakteri beslenmesiyle, dsRNA 2 direkt enjeksiyonu ile elde edilebilir. Hayvanın en hücreleri SID-1, 5 dsRNA&#39;yı ithal edebilen bir transmembran kanalı ifade olarak bu teslim yöntemlerin her sistemik devirme etkilere neden olabilir. Başlangıçta her seferinde tek tek genlerin ekspresyonunu bir demonte bir karşıt genetik yaklaşım olarak, iki besleme kütüphanelerinin oluşturulmasına şimdi büyük ölçekli genetik ekranlar izin verir. Piyasada bulunan DsRNA kütüphaneleri ba içerirlerTüm C.% 55 veya% 87 ya da temsil cterial klonlar elegans genleri 6, 7. Ne yazık ki, büyük ölçekli dsRNAi besleme ekranlar genellikle değişken devirme verimliliği 8-10 sonuçlanabilir. RNAi Nakavt mutlak seviyesi kolaylıkla ölçülebilir olmasa da, büyük ölçekli ekranlar gözlenen etkinlik yok etme, indirgenmiş RNAi tarafından bozulmasını kaçış kalıntı gene özgü mRNA neden olmalıdır. Bu da, bu ekranlarında hayvanlara yem bakterilerden dsRNA plasmid kaybı doğrudan bir sonucu olabilir. Demonte etkileri beslenen hayvanlara 11 kontrol ile karşılaştırıldığında (eğer varsa) bu fikri desteklemek, hayvanlar bakterinin sadece% 50 bir hedef gene karşı dsRNA&#39;lar ifade ettiği, bakteri karışımları beslenen, önemli ölçüde azalır göstermektedir. C. çoğu genler olarak dsRNAi ekranlarında yaparken gen Nakavt ölçüde kritik bir endişe olur elegans haplosufficient ve böylece gen tanımı, en az% 50 t azaltılmalıdıro kayıp fonksiyon-12 fenotip neden olur. Biz büyük ölçekli ekranlar gerçekleştirmek için daha önceden yayınlanmış besleme protokolleri ve diğerleri 8-10 tarafından bildirilen aynı değişken devirme etkileri bulduk. Olası nedenler için bir arama, biz ekranda hayvanlara beslenen bakterilerin yaklaşık% 60 dsRNA&#39;nın plazmid kaybetmişti bulundu. Biz dramatik azaltır veya ortadan kaldırır plazmid kaybı ve büyük ölçüde devirme etkinliğini arttırır kütüphane çoğaltma ve tarama protokolü geliştirdik. Bu protokol C de büyük ölçekli ekranlar yapmak için uygundur elegans ve ticari olarak temin edilebilen dsRNA kitaplıkları birini ya da taranması için kullanılabilir. Bu protokolü kullanarak, ekrana sırasında hayvanların beslenen bakterilerin esasen% 100 dsRNA kodlayan plazmid korumak ve, incelenen tüm dokularda işlev fenotipleri sağlam ve yüksek nüfuz kaybına yol bulmak.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent/Material</td></tr><tr><td>96-well Falcon düz tabanlı plaka </td><td>Fisher Scientific</td><td>353072</td><td>steril</td></tr><tr><td>yapışkan folyo</td><td>USA Scientific</td><td>2923-0100</td><td></td></tr><tr><td>Nunc omniplate</td><td>Fisher Scientific</td><td>267060</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml derin 96 kuyulu polipropilen Masterblock</td><td>USA Scientific</td><td>5678-0285</td><td>Derin</td></tr><tr><td>kuyu plakaları için</td> otoklavlanabilir Kapaklar <td>USA Scientific</td><td>5665-6101</td><td></td></tr><tr><td>50 ml kombiuçlar</td><td>USA Scientific</td><td>4796-5000</td><td>ayrı ayrı sarılmış</td></tr><tr><td>Rezervuar</td><td>USA Scientific</td><td>2977-8500</td><td>otoklavlanabilir</td></tr><tr><td>12 oyuklu plakalar</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7512</td><td>ayrı ayrı sarılmış</td></tr><tr><td>dsRNA besleme kitaplığı</td><td>Açık Biyosistemler</td><td>RCE1181</td><td>mağaza -80 & C</td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td></td></tr><tr><td>Tetrasiklin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912-100</td><td></td></tr><tr><td>Karbenikilin</td><td></td><td></td><td>teslimat için 2-4 hafta izin verir <a href="http://www.biochemicaldirect.com" target="_blank">www.biochemicaldirect.com</a></td></tr><tr><td>Bakteriyolojik Agar Ultra saf sınıf A </td><td>Affymetrix</td><td>10906</td><td>sonsuz plakalar</td></tr><tr> için<td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Brayer silindiri</td><td>USA Scientific</td><td>9127-2940</td><td></td></tr><tr><td>B&#8211; kel 96 pinli çoğaltıcı</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-9</td><td>otoklavlanabilir</td></tr><tr><td>mikro çalkalayıcı</td><td>Thomas Scientific</td><td>1231A93</td><td>3 mm yörünge</td></tr><tr><td>12 kanallı çok kanallı pipet (0.5-10 &mu; l)</td> <td>USA Scientific</td><td>7112-0510</td><td></td></tr><tr><td>12 kanallı çok kanallı pipet (30-300 &mu; l)</td><td>USA Scientific</td><td>7112-3300</td><td></td></tr><tr><td>Repeater Plus manuel pipetleyici</td><td>USA Scientific</td><td>4026-0201</td><td></td></tr></tbody></table>

büyük ölçekli gen demonte olarak<em&gt; c. elegans</em&gt; sağlam kayıp fonksiyon-fenotipleri oluşturmak için dsrna besleme kitaplıklar kullanma

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

DsRNAlar ifade solucanlar bakterileri besleyerek RNA girişim C gen fonksiyonunu değerlendirmek için yararlı bir araç olmuştur elegans. Genlerin küçük bir sayıda demonte için hedeflenen bu stratejisi iyi çalışıyor olsa da, büyük ölçekli besleme ekranları kendi programını sınırlar, değişken knockdown verimliliğini gösterir. Daha önce yayınlanan RNAi yok etme protokolleri deconstructed ve indirgenmiş Nakavt birincil kaynağı hayvanlara beslenen bakterilerden dsRNA kodlayan plazmidlerin kaybına bağlı olabilir bulduk. Bu gözlemlere dayanarak, biz büyük ölçüde azaltır veya verimli, yüksek verim elde etmek için demonte plazmid kaybı ortadan kaldıran bir DsRNA besleme protokol geliştirdik. Biz bu protokol C. aşağı sağlam, tekrarlanabilir darbe üretecek olduğunu göstermek nöronlar elegans da dahil olmak üzere çok sayıda doku türleri içinde, genler, ve büyük ölçekli ekranlarında etkili demonte izin verecektir. Bu protokol, bir ticari olarak temin edilebilir besleme dsRNA kullanankütüphane ve kütüphane çoğaltmak ve DsRNA ekranları gerçekleştirmek için gereken tüm adımları açıklar. Protokol, bir karmaşık ekipman kullanımını gerektirmez ve bu nedenle herhangi bir C. tarafından yapılabilir laboratuvar elegans.

P0 knockdown fenotipleri DsRNA bakterileri ifade hayvanların beslenmesi 2-3 gün sonra görünmeye başlayacaktır. Bazı erken fenotipleri larva tutuklama ve öldürücülüğü içerir ve tüm beslenme kuyuların% 2-3 dikkat edilmelidir. Bu aynı fenotipleri de F1 üretimi hayvanlarda gözlenecektir. Yumurtadan başarısız F1 yumurta varlığı başka ortak F1 fenotip ve birlikte, bu üç fenotipleri F1 ekranlarında tüm kuyuların yaklaşık 10% olarak görülecektir. Biz P0 ve F1 fenotipleri hem de doku tiplerinin çeşit...

DsRNA C. beslerken elegans büyük ölçekli besleme ekranlar için geçerli protokoller değişken devirme verimleri elde gen fonksiyonunu değerlendirmek için güçlü bir araçtır. Bu gen ifadesinin oldukça etkili ve yeniden üretilebilir bir devirme ile sonuçlanan büyük ölçekli RNAi besleme ekranları yerine getirmek için geliştirilmiş bir protokol açıklar.

Büyük ölçekli Gen demonte olarak<em&gt; C. elegans</em&gt; Sağlam Kayıp fonksiyon-fenotipleri oluşturmak için DsRNA Besleme Kitaplıklar kullanma

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

Bu prosedürün genel amacı, gen ekspresyonunu baskılamak için bir bakteriyel dsRNA besleme kütüphanesi kullanarak C. elegans'ta büyük ölçekli RNA interferans taramaları gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle bir dsRNA kütüphanesindeki bakteriyel klonların kültüre edilmesiyle gerçekleştirilir. Plazmit kaybını önleyen büyüme koşulları altında, önce her bir birincil kütüphane plağının çoğaltılmasıyla başlanır ve ardından agar omni plakları üzerinde geçici bakteri stokları oluşturmak için 96 kuyucuklu kopya kütüphane plağı kullanılır.Bu omni plakalarındaki bakteriler sıvı kültürde gece boyunca büyütülür ve ardından solucan besleme plakalarının yüzeyine aktarılır. Kütüphanedeki her bir bakteriyel klon, knockdown için tek bir C elgan genini hedefleyen benzersiz bir D-S-R-N-A kodlayan plazmid taşır. İkinci adım, senkronize edilmiş solucanların besleme plakalarına yerleştirilmesidir.Ardından, solucanlar nemlendirilmiş bir oda içerisinde 20 °C'de birkaç gün boyunca büyütülür. Solucanlar bakterilerle beslendikçe, indüklenen DS RNA'lar hayvanın bağırsağına salınır ve buradan çevre dokulara yayılarak sistemik nakavt etkileri oluşturur. Son adım, beslenen hayvanların gene özgü nakavt nedeniyle

large-scale-gene-knockdown-c-elegans-using-dsrna-feeding-libraries-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz protein ekspresyonu ve lokalizasyonu postembryonic düzenleyiciler tanımlamak için duyarlı bir yöntem...

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans</em

Nicel ve Otomatik Yüksek throughput Genom çapında RNAi Ekranlar C. elegans</em

Biz hedef genler ve skoru vücut büyüklüğüne fenotipi yıkmak için RNAi besleme tekniği nasıl kullanılacağını...

Nematod Vücut büyüklüğü Yönetmelik ilgilendim Genler için Ekran RNA-aracılı Girişim Besleme Strateji Kullanımı<em&gt; C. elegans</em

RNAi, C. elegans araştırmacılarının kullanabileceği güçlü bir genetik araçtır. Bu video, sıvı kültür koşullarını kullanarak plaka beslemeden daha fazla solucanı RNAi ile tedavi etmek için bir yöntem sunmaktadır.

Sıvı Kültürde RNAi Besleme: C. elegans'ta Gen Ekspresyonunu Yıkmak İçin Yüksek Verimli Bir Yöntem

Kaynak: Anderson, Q. L. ve diğerleri. Yüksek verimli, Yüksek içerikli, Sıvı bazlı bir C. elegans Patosystem. J. Vis. Uzm. (2018)Bu video, konakçı-patojen etkileşimleri sırasında gen yıkımlarını incelemek için Caenorhabditis elegans kullanan yüksek verimli bir tarama yöntemini göstermektedir. Patojen kaynaklı solucan öldürmenin etkilerini değerlendirmek için devrilme solucanlarının hazırlanması ve bunların tahlil plakalarına aktarılması prosedürünü özetlemektedir.

C. elegans Knockdown'ların Taranması için Çok Kuyulu Sıvı Bazlı Bir Test

Burada, laboratuarda bir ara-germ böceği, Dermestes maculatus (D. maculatus) yetiştirme için protokolleri sunuyoruz. Biz de bu türün gen fonksiyonunu incelemek için embriyonik fenotipleri analiz etmek için embriyonik ve ebeveyn RNAi için protokolleri ve yöntemleri paylaşır.

Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı, Dermestes maculatus

Refakatçi-refakatçi ve refakatçi-substrat etkileşimlerini incelemek için, hafif mutasyonlar veya refakatçilerin aşırı ekspresyumu ile birlikte RNA paraziti kullanarak Caenorhabditis elegans'ta sentetik etkileşim ekranları gerçekleştiriyoruz ve dokuya özgü protein disfonksiyonunu organizma düzeyinde izliyoruz.

Dokuya Özgü Chaperone Etkileşimlerini Taramak için Caenorhabditis elegans'ı Kullanma

RNA paraziti, gen ekspresyonunu belirli gelişimsel evrelerde manipüle etmek için yaygın olarak uygulanabilir ve güçlü bir tekniktir. Burada, sudalış böceği Thermonectus marmoratusbu tekniğiuygulamak için gerekli adımları açıklar , gen dizilerinin edinimi gelen yapı veya davranışı etkileyen genlerin yıkılması.

Belirli Gelişimsel Zaman Noktalarında Gen İfadesi Manipüle Etmek Için Güçlü Bir Araç Olarak Su Böcekleri RNA Girişim

Caenorhabditis elegans, sağlık süresini, ömrünü ve strese karşı dayanıklılığı araştırmak için sağlam ve düşük maliyetli yöntemlerle mükemmel bir model sistem olarak hizmet eder.

Caenorhabditis elegans'ta Yaşam Süresini ve Sağlık Süresini Ölçmek için Düşük Maliyetli Yöntemlerin İncelenmesi

Metagenomic Kütüphaneler Büyük Ölçekli Ekranlar

Keşfedin C. elegans'ta gen fonksiyonlarını incelemek için dsRNA besleme kitaplıklarıyla büyük ölçekli RNAi tarama yöntemini. Bu protokol, gen susturma verimliliğini artırarak nörobilim ve genetik araştırmalarına katkı sağlar.

Büyük ölçekli Gen demonte olarak C. elegans Sağlam Kayıp fonksiyon-fenotipleri oluşturmak için DsRNA Besleme Kitaplıklar kullanma (Video) | JoVE Journal

Büyük ölçekli Gen demonte olarak

Daha fazla video keşfet