Büyük ölçekli Gen demonte olarak C. elegans Sağlam Kayıp fonksiyon-fenotipleri oluşturmak için DsRNA Besleme Kitaplıklar kullanma

Bu prosedürün genel amacı, gen ekspresyonunu yıkmak için bir bakteriyel DS RNA besleme kütüphanesi kullanarak C zarafetinde büyük ölçekli RNA girişim ekranları gerçekleştirmektir. Bu, ilk olarak bir DS RNA kütüphanesinden bakteri klonlarının kültürlenmesiyle gerçekleştirilir. Plazmit kaybını önleyen büyüme koşulları altında, her bir birincil kütüphane plakasını çoğaltarak ve daha sonra agar omni plakaları üzerinde geçici bakteri sapları oluşturmak için 96 iyi çoğaltılmış kütüphane plakasını kullanarak başlayın.

Bu omni plakalardan gelen bakteriler gece boyunca sıvı kültürde büyütülür ve daha sonra solucan besleme plakalarının yüzeyine aktarılır. Kütüphanedeki her bakteri klonu, yıkım için bir C elgan genini hedefleyen benzersiz bir DSRNA kodlama plazmidi taşır. İkinci adım, senkronize solucanları besleme plakalarına yerleştirmektir.

Daha sonra, solucanlar 20 santigrat derecede nemlendirilmiş bir odada birkaç gün boyunca büyütülür. Solucanlar bakterileri beslerken, indüklenen DS RNA'ları hayvanın bağırsağına salınır ve daha sonra sistemik yıkım etkilerine neden olmak için çevre dokulara yayılır. Son adım, beslenen hayvanları gene özgü yıkımın neden olduğu fenotipik etkiler açısından incelemektir.

Bu fenotipik tahliller, incelenen biyolojik süreç için önemli olan genleri tanımlamak için kullanılır. Bu tekniğin, çift sarmallı RNA'ların solucan gonadına mikroenjeksiyonu gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, yüksek verim olmasıdır. Beslenme kütüphanelerini kullanarak, neredeyse tüm deniz elginlerinin genlerinin biyolojik işlevini sadece birkaç hafta içinde inceleyebiliriz.

Birçok laboratuvar bu nakavt yaklaşımıyla mücadele etti çünkü çoğu gen ve C zarafeti haplo yeterli. Ve böylece RNA yıkımı, fonksiyon kaybı fenotipleri üretmek için gen ekspresyonunu %50'den fazla azaltmalıdır. Sağlam gen yıkımını sağlamak için, solucanlara beslenen tüm bakterilerin çift sarmallı RNA plazmidini eksprese etmesi çok önemlidir.

Plazmit kaybını belirleme prosedürüne başlamak için, ilgili her adımda tarif edildiği gibi küçük bir bakteri örneğini çıkarın ve 450 mikrolitre steril suya ekleyin. Steril su kullanarak daha fazla seri seyreltme oluşturmak için bu seyreltilmiş numuneden 100 mikrolitre kullanın. Çözeltileri seyreltmeler arasında iyice karıştırın.

Her seyreltmenin 100 mikrolitresini LB ve LB AMP plakalarına yayın ve ertesi gün gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin, 100 ila 500 bakteri kolonisi içeren LB plakasını tanımlayın. Bu plakadaki ve aynı bakteri seyreltmesini içeren karşılık gelen lb amp plakasındaki koloni sayısını sayın. Bu denklemi kullanarak plazmit kaybını belirleyin.

Plazmit içermeyen bakterilerin yüzdesi, LB amp plakasındaki koloni sayısının LB plakasındaki koloni sayısından çıkarılması, LB plakasındaki koloni sayısına bölünmesi ve 100 ile çarpılmasıyla hesaplanır Plazmit kaybı, yüksek konsantrasyonlarda karbonik sellin bakteri yetiştirmesiyle önlenir Etkili nakavt için. Hayvanları beslemeden önce plazmit kaybını kontrol edin ve yalnızca plazmit kaybı %15'ten azsa devam edin. Kültürler hala donmuşken folyo contayı çıkarın.

Plakaların plastik kapağını değiştirin ve yinelenen kitaplık plakalarını oda sıcaklığında 30 dakikadan fazla olmamak üzere çözülmesi için düz bir yüzeye koyun. Buccal 96 pin çoğaltıcıyı sterilize edin. Bir etanol banyosuna koyun ve ardından etanolü yakın.

Bir topuz ve brülör kullanarak pimleri kaplayın. Alevin sönmesine izin verin ve ardından tekrarlayın. Temiz bir çoğaltıcının pimleri damıtılmış su ile durulanmalı ve ardından her kullanımdan önce sterilize edilmelidir.

Sterilize edilmiş çoğaltıcıyı çözülmüş kopya plakanın kuyucuklarına yerleştirin ve kültürleri nazikçe karıştırmak için kullanın. Kültürün küçük hacimleri, çoğaltıcının pimlerine yapışacaktır. Çoğaltıcıyı çift plakanın yuvalarından dikkatlice çıkarın ve omni plakanın yüzeyine nazikçe pimli olarak yerleştirin.

Agar yüzeyini delmemeye dikkat edin. Çoğaltıcıyı omni plakanın yüzeyinde üç ila dört saniye bekletin, böylece çoğaltıcının pimlerinden gelen bakteriler agar yüzeyine aktarılır. Katı ortamda plazmit kaybını önlemek için, yemek mililitre başına iki miligram içerir.

Karbonik satış. Çoğaltıcıyı çıkarın ve küçük hacimli bakteri kültürünün agar içine emilmesine izin verin. Her iki plaka da çoğaltıldıktan sonra.

Omni plakaları ertesi sabah 37 santigrat derecede 15 ila 18 saat ters çevrilmiş olarak inkübe edin. Bu omni plakalar ya 96 kuyu sıvı kültürü aşılamak için kullanılabilir ya da dört santigrat derecede yedi güne kadar saklanabilir. Solucanları beslemek için bakteriler, bir tekrar pipetleyici ve 50 mililitrelik bir kombi ucu kullanılarak omni plakalardan gelen bakteriler kullanılarak sıvı kültürler olarak hazırlanır, her iki mililitreye bir mililitre bakteri üreme ortamı dağıtır.

96 oyuklu bir plakanın derin kuyusu, çoğaltıcıyı sterilize eder ve bakteri kolonileri içeren bir omni plakanın yüzeyine yerleştirin, böylece pimlerin 96 bakteri kolonisinin her biri ile temas halinde olduğundan emin olun. Çoğaltıcıyı omni plakanın yüzeyinden derin kuyu plakasına dikkatlice hareket ettirin ve pimlerin büyüme ortamına daldırılana kadar derin kuyucukların kenarlarını sıyırmadığından emin olun. Bakterileri büyüme ortamına çıkarmak için.

Çoğaltıcıyı, derin kuyu plakasının iç duvarını takip ederek kare hareketle yavaşça hareket ettirin. Kuyuları sıçratmamaya ve kirletmemeye dikkat edin. Her 96 kuyu derin kuyu kültür plakası için iki kontrol dahil edilmelidir.

Beklenen yıkım için pozitif kontrol olarak DS RNA eksprese eden bakteriler, negatif kontrol olarak boş DS RNA vektörü içeren bakteriler fenotip. Steril bir aşılama halkası kullanarak, pozitif kontrol plakasından iyi izole edilmiş tek bir koloniyi çıkarın ve plaka adı verilen derin kuyuda boş bir kuyu aşılayın. Aşılanmış kuyunun konumunu kaydedin.

Negatif kontrol için tekrarlayın. Derin kuyu plakalarını gece boyunca 650 santigrat derecede bir mikro çalkalayıcı üzerinde 37 RPM'de düz bir konumda çalkalayın. Kültürlerin gece boyunca inkübe edilmesinden sonra, 96 derin kuyu plakasından gelen bakteriler 12'ye aktarılacaktır.

Kuyu besleme plakaları transferi bir seferde dört kuyu yapılabilir. Pipet uçlarını 12 kanallı çok kanallı pipetin her üç kanalına yerleştirin. Derin kuyu plakasından 150 mikrolitre bakteri kültürünü çıkarın ve 12 kuyu besleme plakasının dört oyuğunun yüzeyine çıkarın.

Solucanlar yuva yapacağından ve DS RNA eksprese eden bakterileri beslemeyeceğinden transfer sırasında agarın yüzeyini delmemek önemlidir. Dört oyuklu her bir set aktarıldıktan sonra, dört pipet ucunu dört yeni steril pipet ucuyla değiştirin ve besleme plakasının sonraki dört kuyusunu tohumlayın, tohumlanmış plakaları gece boyunca karanlıkta oda sıcaklığında dik olarak saklayın, böylece bakteriler agarı emebilir. L'yi transfer etmeden önce, bir besleme süzgeci için DS RNA besleme plakalarına tutuklanan bir C elgan larvası.

Önceden hazırlanmış L one tutuklanmış larvaların konsantrasyonu belirlenmelidir. Hayvanları dağıtmak için tutuklanan L one larvalarını içeren erlenmeyer şişesini karıştırın. Daha sonra 10 mikrolitrelik bir alikotu çıkarın ve oturmamış altı santimetrelik bir NGM plakasına damla damla yerleştirin.

Plakanın ortasından dört ila beş damla içinde. Tüm ortamların pipetten atıldığından emin olun. Pipet ucunun ucunu kullanarak, plakanın çapı boyunca uzanan tek bir sürekli sıvı hattı oluşturmak için solucan süspansiyonu noktalarını yayın.

Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, sıvı hattının bir ucundan başlayarak ve sıvı plakaya emilmeden ve hayvanlar dağılmadan önce diğer uca devam ederek tüm hayvanları sayın. Bu, hiçbir hayvanın kaçırılmadığından emin olmak için diseksiyon kapsamının sürekli olarak yeniden odaklanmasını gerektirebilir. Mikrolitre solucan süspansiyonu başına ortalama solucan sayısını belirlemek için bu sayma prosedürünü üç ayrı 10 mikrolitrelik alikot için tekrarlayın ve bu sayıyı doğrudan erlenmeyer şişesine kaydedin.

Besleme süzgecini başlatmak için, mililitre başına 2000 solucan içeren bir çözelti hazırlamak için L bir tutuklu larva ve steril suyun süspansiyonunu kullanın. Her 12 kuyulu besleme plakası, hayvanların eşit dağılımını sağlamak ve hayvanları pipetleme için steril bir rezervuara aktarmak için bu solucan süspansiyonunun 120 mikrolitresinin iyice karıştırılmasını gerektirecektir. Uçları her üç pozisyonda bir olacak şekilde ayarlanmış çok kanallı pipeti kullanarak, 10 mikrolitre solucan solüsyonunu doğrudan besleme plakalarının bakteri çimine aktarın.

Agarın yüzeyini delmemeye dikkat edin, çünkü solucanlar agarın içine girer ve D-S-R-N-A ifade eden bakterilerle beslenmez. Solucan çözeltisinin her iki sıra besleme plakasına aktarılmasından sonra, solucan çözeltisini, solucanlar yerleştikçe hafifçe çalkalayarak rezervuardaki yeniden karıştırın, her bir kuyucuğun 20 ila 30 solucan aldığından emin olmak için diseksiyon kapsamı altında birkaç kuyuyu hızlı bir şekilde inceleyin. Tüm besleme plakalarında solucanlar olduğunda, solucan süspansiyonu plakaya emildikten sonraki gün plakaları 20 derecelik bir inkübatörde nemlendirilmiş bir kutuda dik olarak saklayın, plakaları ters çevirin ve 20 santigrat derecede neme geri dönün.

Bu plakalardaki hayvanlar, P sıfır fenotipleri için üç gün sonra ve daha sonra F1 fenotipleri için altı gün sonra tekrar gözlemlenebilir. Burada tarif edilen protokol, knockdown yumurtası L 30, dumpy 17, PAT 10 için dört geni test etmek için kullanıldı ve dört yumurta L 30 ve dördü sinir sisteminde ifade edildi. Pat 10 vücut duvarı kasında ve dumpy 17 epidermal hücrelerde eksprese edilir.

Erie one Lin 15 B mutantları, negatif kontrol olarak RNAi'ye karşı gelişmiş duyarlılıkları nedeniyle ekranlarda kullanıldı. Solucanlar, beklendiği gibi bir DS RNA eksprese etmeyen boş PL 44 40 plazmidini içeren bakterilerle beslendi. Boş plazmit içeren bakterilerle beslenen RIE one Lin 15 B hayvanlarında herhangi bir morfolojik veya davranışsal kusur görülmedi.

Bu fotoğraf, normal vücut duruşlarının kanıtladığı gibi serbestçe hareket eden hayvanları göstermektedir. Siyah ok, genç yetişkin bir hayvanın konumunu gösterir. Beyaz ok, bir grup bırakılan yumurtanın konumunu gösterir.

Solucanların normal davranışı bu video klipte gösterilmektedir, yumurta L 30, G-protein alt birimi G alfa Q'nun deniz zarafeti orto günlüğünü kodlar. L bir aşamalı Erie bir Lin 15 B larvaları, yumurta L 30 DS RNA'sını ifade eden bakterilerle beslendi. Larvalar, hareket ve yumurtlama davranışında belirgin kusurlar gösteren yetişkinler haline geldi. Üç gün sonra, L 30 yumurtasına karşı DS RNA ile beslenen hayvanların% 100'ü felç oldu ve yumurtlayamadı.

Bu fotoğraf, tüm hayvanların felçli hayvanlara özgü sert bir görünüm benimsediğini göstermektedir. Plakaya bırakılan yumurtaların tamamen yokluğuna da dikkat edilmelidir. Dumpy 17, denizde kütikül oluşumu için gerekli olan bir kolajen proteinini kodlar.

Elgan ve dumpy 17 boş mutantları, vahşi tip hayvanlardan daha kısa ve daha şişmandır. Bu deneyde, dumpy 17 D-S-R-N-A ile beslenen P zero hayvanlarda herhangi bir morfolojik kusur gözlenmemiştir. Bununla birlikte, bu şekilde gösterildiği gibi F1 hayvanlarının %98'i dumpy fenotipini göstermiştir.

Biri okla işaretlenmiş olan tarladaki yetişkin hayvanların, siyah okla işaretlenmiş yetişkin hayvandan daha kısa ve daha şişman olduğuna dikkat edin. Panel A'da, kısa ve şişman P sıfır hayvanların eksikliği, uygun vücut morfolojisi için erken larva evrelerinde dumpy 17 gen fonksiyonunun gerekli olduğunu göstermektedir. Pat 10, kalsiyumu bağlayan dört EF el motifi içeren vücut duvarı kas troponin CA proteinini kodlar.

Bu çalışmada, Pat 10 DS RNA ile beslenen Erie one Lin 15 B hayvanlarının %100'ünün üç gün içinde felç olduğu ve hiç yumurta bırakmadığı ve bunun ölümcül bir fenotipe yol açtığı görülmüştür. Hayvanlar felçli olmasına rağmen, ventral kord motor nöronlarında eksprese edilen ve uygun sinaptik girdi için gerekli olan bir homeo alan proteini olan dört kodda okla işaretlenmiş başın yakınındaki bakterilerin temizlenmesiyle belirtildiği gibi beslenmek için baş kaslarını hareket ettirebileceklerini unutmayın. Bu çalışmada test geni olarak dört seçenek seçilmiştir çünkü önceki DS RNA besleme stratejilerine dirençli olduğu kanıtlanmıştır.

Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, kütüphane preparatından bakteri eksprese eden dört DS RNA ile beslenen hayvanların% 62'sinin, kafaya dürtüldüğünde sinüzoidal bir hareketle serbestçe geri dönen vahşi tip hayvanlara kıyasla hareket davranışında kusurlar gösterdiğini, UNC dört boş mutantın geri dönmediğini, bunun yerine sıkıca kasılarak dorsal bir fleksöre neden olduğunu göstermiştir. Bu genellikle o kadar aşırı hale gelir ki, hayvanın başı ve kuyruğu temas eder ve vücudu sarmal bir pozisyona getirir. Bu tablo, test edilen dört genin her birine karşı DS RNA ile beslendiğinde sıfır benzeri fenotipler sergileyen hayvanların yüzdesini göstermektedir: Her bir nakavt deneyi için 100 hayvan incelenmiştir. Bu sonuçlar, DS RNA'nın başarısı için plazmit retansiyonunun önemini göstermektedir.

Girişim ekranları, sağlam ve penetran oranı yüksek fonksiyon kaybı fenotipleri tüm dokularda gözlenebilir. Solucanlara beslenen bakterilerin tamamı DS RNA'yı eksprese ettiğinde, bir kez ustalaştıktan sonra, tüm besleme kütüphanesi yaklaşık iki ay içinde bir kişi tarafından taranabilir. Verimi artırmak için, her bakteri klonunu bir besleme süzgecinde yalnızca bir kez test ediyoruz.

Kütüphaneden ilk geçişte tanımlanan herhangi bir gen daha sonra yeniden test edilir. Üçlü olarak, genin pozitif bir isabet olarak karesinin alınması için tüm yeniden testlerde istenen fenotipin gözlemlendiği konusunda ısrar ediyoruz. Plazmit daha sonra bakterilerden saflaştırılır ve kodlanmış genin kimliğini doğrulamak için dizilenir.

Bir gen tanımlandıktan sonra, eğer mevcutsa bir L mutantı sipariş ediyoruz ve genin herhangi bir ek karakterizasyonunu gerçekleştirmeden önce istenen fenotip için test ediyoruz.